FSTL1及MMP-2在子癇前期孕婦胎盤組織及滋養細胞中的表達及相關性研究*

馬紅柳，饒海英，漆洪波，羅　欣（.墊江縣人民醫院婦產科，重慶408000；.重慶醫科大學附屬第一醫院產科，重慶40006）

FSTL1及MMP-2在子癇前期孕婦胎盤組織及滋養細胞中的表達及相關性研究*

馬紅柳1，饒海英2，漆洪波2，羅欣2（1.墊江縣人民醫院婦產科，重慶408000；2.重慶醫科大學附屬第一醫院產科，重慶400016）

目的探討卵泡抑素樣蛋白1（FSTL1）及基質金屬蛋白酶2（MMP-2）在子癇前期孕婦胎盤組織及滋養細胞中的表達及相關性。方法以2014年1月至2015年9月在重慶醫科大學附屬第一醫院產科住院行剖宮產術的子癇前期孕婦35例和正常足月妊娠行擇期剖宮產術孕婦40例為研究對象，采用蛋白質印跡法檢測正常晚期妊娠孕婦和子癇前期患者胎盤組織中FSTL1和MMP-2蛋白的表達；采用免疫熒光法檢測正常培養和缺氧/復氧（H/R）處理的人早孕期絨毛膜外滋養細胞株HTR8/SVneo中FSTL1和MMP-2的表達；采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測兩組孕婦血清FSTL1水平，分析FSTL1和MMP-2表達水平與子癇前期的相關性。結果與正常足月妊娠胎盤組織比較，子癇前期患者胎盤組織中FSTL1水平明顯升高，而MMP-2水平明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與正常培養的細胞比較，H/R處理的細胞FSTL1蛋白水平明顯升高，而MMP-2水平明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）；FSTL1主要定位于HTR8/SV-neo細胞質中。正常足月妊娠孕婦血清FSTL1水平顯著低于子癇前期孕婦，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論胎盤組織和血清中FSTL1和MMP-2水平的異常變化可能與子癇前期發病有關，二者可能存在協同作用。通過研究FSTL1和MMP-2的相互作用，可為子癇前期發病機制的研究提供新思路。

先兆子癇；胎盤；滋養層；卵泡抑素；基質金屬蛋白酶2；氧化性應激；孕婦

子癇前期是一種妊娠期特發的全身性疾病，其病因和發病機制目前仍未完全闡明，嚴重威脅圍生期母兒安全。卵泡抑素樣蛋白1（follistatin-like protein 1，FSTL1）又名轉化生長因子 β1誘導蛋白36（transforming growth factor-β1-stimulated clone36，TSC-36）或卵泡抑素相關蛋白（follistatinrelated protein，FRP），是細胞外基質蛋白家族成員之一［1］，其具有調控細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學功能［2］。近年來有文獻報道，FSTL1參與了炎癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等的發生和發展［3-4］，但其與子癇前期發病的相關性尚不清楚。本研究通過檢測子癇前期孕婦胎盤組織及血清中FSTL1的表達，以及缺氧/復氧（H/R）條件下人早孕期絨毛膜外滋養細胞株HTR8/SVneo中FSTL1、基質金屬蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP-2）的表達情況，初步探討二者與子癇前期發病的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料以2014年1月至2015年9月在重慶醫科大學附屬第一醫院產科住院行剖宮產術的子癇前期孕婦35例（診斷標準參照《婦產科學》第8版全國統編教材［5］，子癇前期組）和正常足月妊娠行擇期剖宮產術孕婦40例（正常對照組）為研究對象。均為單胎妊娠；既往無高血壓、心臟病、腎臟病、糖尿病及甲狀腺功能亢進等病史；無復發性自然流產、畸胎、死胎等不良孕產史；無吸煙、長期服用藥物史。要求孕期無急、慢性感染性疾病；胎兒無畸形。兩組孕婦年齡、體質量指數、孕產次、孕周、新生兒性別等比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　兩組孕婦一般資料比較

1.2方法

1.2.1標本采集入院后，于治療和分娩前采集兩組孕婦空腹肘靜脈血5 mL，離心分離收集血清，樣品轉入-80℃冰箱保存待測。剖宮產孕婦胎盤娩出后5 min內，避開肉眼可見的鈣化灶及壞死區，取胎盤母體面中央組織約1.0 cm3大小，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer aolution，PBS）漂洗后立即置于液氮中保存，過夜后轉入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2蛋白質印跡法檢測胎盤組織及HTR8/SVneo細胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表達嚴格按照蛋白質提取試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）說明書提取胎盤組織和HTR8/SVneo細胞總蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白水平（南京凱基生物技術研究所）。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF，美國Millipore公司），室溫封閉1 h后，分別加入羊抗人FSTL1單克隆抗體（1∶1 000，美國Abacm公司）、兔抗人MMP-2單克隆抗體（1∶1 000，美國Abacm公司）和兔抗人β-actin單克隆抗體（1∶1 000，美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜。分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶1 000，北京中杉金橋生物技術有限公司）和兔抗羊IgG（1∶1 000，美國Gene Tex公司）二抗，室溫孵育1 h。加入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液（南京凱基生物技術有限公司），利用ChemiDoc XRS化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）檢測蛋白質印跡各條帶灰度，用Quantity One 4.6.2版圖像分析軟件進行分析。

1.2.3細胞免疫熒光檢測HTR8/SVneo細胞中FSTL1的表達HTR8/SVneo細胞按參考文獻［6］進行正常培養（正常培養組）和H/R培養（H/R組），H/R培養方法為先缺氧培養8 h后再常氧培養16 h 2個循環，共計48 h后再行固定、1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton×100）透化、封閉后，滴加羊抗人FSTL1單克隆抗體（1∶50），置于濕盒，4℃孵育過夜。滴加異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的兔抗羊熒光二抗（1∶50，美國Earthox公司），37℃孵育1 h，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染細胞核，甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica，德國）下觀察著色部位及熒光強度。

1.2.4孕婦血清中FSTL1水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測兩組孕婦外周血FSTL1水平。FSTL1 ELISA檢測試劑盒購自上海潤裕生物科技有限公司，操作按說明書進行。所有標本均行3個復孔檢測且為同批測定，取平均值為最終檢測水平，批內變異系數（coefficient variations，CV）＜0.5%。

1.3統計學處理應用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1兩組孕婦胎盤組織中FSTL1和MMP-2蛋白的表達子癇前期組孕婦胎盤組織中FSTL1蛋白表達水平較正常對照組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　兩組孕婦胎盤組織中FSTL1和MMP-2蛋白的表達

2.2HTR8/SVneo細胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表達H/R組HTR8/SVneo細胞FSTL1蛋白表達水平較正常培養組明顯升高，而MMP-2表達水平較正常培養組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2　HTR8/SVneo細胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表達

2.3FSTL1在HTR8/SVneo細胞中的表達定位FITC標記的熒光二抗結合FSTL1蛋白呈綠色熒光；DAPI標記的細胞核呈藍色熒光。通過兩組圖片的合并（Merged）顯示，FSTL1主要表達在細胞質中，H/R組熒光強度較正常培養組增強。見圖3。

圖3　FSTL1蛋白在HTR8/SVneo細胞中的表達定位（200×）

2.4兩組孕婦血清FSTL1水平比較子癇前期組孕婦血清FSTL1水平顯著高于正常對照組［分別為（5.21±0.92）、（8.18±0.67）μg/mL］，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3　討　論

FSTL1屬于細胞外基質蛋白家族，存在于大部分哺乳動物中，可由多種細胞分泌。FSTL1具有多種生理功能，參與多種生物學過程，包括細胞遷移、增殖、凋亡、新陳代謝、分化、免疫反應及內分泌功能等［1，7］。有研究表明，FSTL1可能與腫瘤細胞轉移和浸潤有關［8］。Chan等［9］應用PCR檢測了45例子宮內膜癌及16例卵巢癌患者癌組織中FSTL1的表達，結果發現，與正常對照組織比較，FSTL1的表達是下調的。將FSTL1過表達慢病毒轉染入內膜癌細胞及卵巢癌細胞，發現腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力減弱。而有關FSTL1在人類胎盤組織中的表達情況的研究較少。Mouillet等［10］通過PCR、蛋白質印跡等方法證實FSTL1在人類胎盤組織絨毛外滋養細胞中特異性表達。

MMPs是一組具有許多共同生化性質的可降解細胞外基質的酶，其異常表達可導致一些病理過程的發生。MMPs與腫瘤細胞轉移和侵襲能力密切相關。以往研究已證實，MMPs的異常表達與子癇前期存在密切關系［11］。滋養細胞侵襲的關鍵在于對基質成分的水解及基底膜的穿越，而基底膜的主要成分包括Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、硫酸類肝素蛋白多糖等，這些均是MMPs的作用底物。由此可見，MMPs在這一過程中起著關鍵作用。

本研究發現，FSTL1主要表達在胎盤的滋養細胞中，子癇前期患者胎盤組織中FSTL1表達水平較正常胎盤組織顯著升高，且子癇患者血清FSTL1水平也高于正常孕婦，證實其表達異常與子癇前期具有相關性，且可能與滋養細胞的侵襲能力有關。而Chaly等［3］研究證實，通過H/R培養HTR8/SVneo細胞可以誘發顯著的氧化應激，與子癇前期胎盤組織類似。本研究利用該模型證實，H/R組HTR8/SVneo細胞FSTL1蛋白表達水平顯著高于正常培養組，表明氧化應激可以觸發FSTL1在滋養細胞中的異常表達，與前文所述子癇前期中FSTL1表達升高相呼應。本研究進一步證明，在子癇前期胎盤和H/R處理的 HTR8/SVeno細胞中MMP-2活性下降。FSTL1蛋白可通過抑制MMP的表達抑制腫瘤細胞的轉移和浸潤，表明在子癇前期中由于氧化應激刺激FSTL1的表達，抑制了MMP-2的活性，從而引起滋養細胞侵襲能力下降。

子癇前期的發生是一個多因素、分階段的動態進展過程，而滋養細胞的侵襲能力受損在此過程中發揮著舉足輕重的作用。本研究通過檢測子癇前期及正常足月妊娠者胎盤組織和血清中FSTL1及MMP-2在胎盤組織中的表達，并通過采用H/R滋養細胞模型模擬子癇前期，進一步證實了目的蛋白在氧化應激下的異常表達情況，初步探討了FSTL1和MMP-2在子癇前期發病中的作用，期望能為子癇前期的發病機制研究提供新的靶點和理論依據。

［1］Wei K，Serpooshan V，Hurtado C，et al.Epicardial FSTL1 reconstitution regenerates the adult mammalian heart［J］.Nature，2015，525（7570）：479-485.

［2］Hayakawa S，Ohashi K，Shibata R，et al.Cardiac myocyte-derived follistatin-like 1 prevents renal injury in a subtotal nephrectomy model［J］.J Am Soc Nephrol，2015，26（3）：636-646.

［3］Chaly Y，Hostager B，Smith S，et al.Follistatin-like protein 1 and its role in inflammation and inflammatory diseases［J］.Immunol Res，2014，59（1/3）：266-272.

［4］Kudo-Saito C，Fuwa T，Murakami K，et al.Targeting FSTL1 prevents tumor bone metastasis and consequent immune dysfunction［J］.Cancer Res，2013，73（20）：6185-6193.

［5］謝幸，茍文麗.婦產科學［M］.8版.北京：人民衛生出版社，2013：67.

［6］Luo X，Yao ZW，Qi HB，et al.Gadd45α as an upstream signaling molecule of p38 MAPK triggers oxidative stress-induced sFlt-1 and sEng upregulation in preeclampsia［J］.Cell Tissue Res，2011，344（3）：551-565.

［7］Fan N，Sun H，Wang Y，et al.Follistatin-like 1：a potential mediator of inflammation in obesity［J］.Mediators Inflamm，2013，2013：752519.

［8］Chen SX，Xu XE，Wang XQ，et al.Identification of colonic fibroblast secretomes reveals secretory factors regulating colon cancer cell proliferation［J］.J Proteomics，2014，110：155-171.

［9］Chan QK，Ngan HY，Ip PP，et al.Tumor suppressor effect of follistatinlike 1 in ovarian and endometrial carcinogenesis：a differential expression and functional analysis［J］.Carcinogenesis，2009，30（1）：112-114.

［10］Mouillet JF，Mishima T，Paffaro AM，et al.The expression and post-transcriptional regulation of FSTL1 transcripts in placental trophoblasts［J］. Placenta，2015，36（11）：1231-1238.

［11］Vincent ZL，Mitchell MD，Ponnampalam AP.Regulation of MT1-MMP/ MMP-2/TIMP-2 axis in human placenta［J］.J Inflamm Res，2015，8：193-200.

Study on expression and correlation of FSTL1 and MMP-2 in placenta tissue and trophoblasts in preeclampsia pregnant women*

Ma Hongliu1，Rao Haiying2，Qi Hongbo2，Luo Xin2（1.Department of Gynecology and Obstetrics，Dianjiang County People′s Hospital，Chongqing 408000，China；2.Department of Obstetrics，First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo detect the expression and correlation of follistatin-like protein 1（FSTL1）and matrix metalloproteinase-2（MMP-2）in placenta tissue and trophoblasts in preeclampsia pregnant women.MethodsThirty-five preeclampsia pregnant women and 40 normal full term pregnant women undergoing cesarean section in the obstetric department of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from January 2014 to September 2015 were taken as the research subjects. Western blotting was adopted to detect the expression of FSTL1 and MMP-2 protein in placental tissues；the expressions of FSTL1 and MMP-2 in human early pregnancy extrachorionic trophoblastic cell lines HTR8/SVneo by normal culture and hypoxia/re-oxygenation（H/R）treatment were detected by adopting immunofluorescence assay；the enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to examine the levels of FSTL1 in serum in the two groups.The correlation between FSTL1 and MMP-2 expression levels with preeclampsia was analyzed.ResultsThe expression level of FSTL1 in placenta tissues of preeclampsia patients was significantly increased compared with placenta tissue in full term pregnancy，while the expression level of MMP-2 was significantly reduced，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expression level of FSTL1 protein in the cells of H/R treatment was significantly increased compared with that in the normal culture group，while the expression level of MMP-2 was significantly reduced，and the differences were statistically significant（P＜0.05）；the positioning of FSTL1 was primarily located in cytoplasm of HTR8/SVneo.The serum FSTL1 level in the full term pregnant women group was significantly lower than that in the preeclampsia pregnant women，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionThe abnormal changes of FSTL1 and MMP-2 expression in placental tissues and serum may contribute to the pathogenesis of preeclampsia，the two may have synergistic effect. Studying the interaction of FSTL1 and MMP-2 may provide a new idea for the research of preeclampsia pathogenesis.

Pre-eclampsia；Placenta；Trophoblasts；Follistatin；Matrix metalloproteinase 2；Oxidative stress；Pregnant women

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.005

A

1009-5519（2016）13-1967-03

國家自然科學基金資助項目（81300509、81471472）。

馬紅柳（1974-），主治醫師，主要從事婦產科常見病及多發病臨床診療工作。

（2016-03-11）