正交試驗法優選增率復脈顆粒水提工藝

張大軍，張曉華，王兆華

(吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012)

正交試驗法優選增率復脈顆粒水提工藝

張大軍*，張曉華，王兆華

(吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012)

確定增率復脈顆粒的最佳水提工藝。方法：應用高效液相色譜法和正交實驗法，以增率復脈方中活性成分丹參素轉移率及全方干膏得率為指標，確定增率復脈顆粒的最佳水提工藝參數。結果：增率復脈顆粒最佳水提工藝為：處方飲片加10倍量水，煎煮2次，每次2h。結論：經試驗優選出的水提工藝穩定可靠，適用于增率復脈顆粒的提取。

增率復脈顆粒；HPLC法；正交實驗法；丹參素

增率復脈顆粒由丹參、黃芪、桂枝等八味中藥組成，是吉林省中醫藥科學院內科應用于臨床多年的經驗方。用于治療病態竇房結綜合癥(心動過緩)，可明顯增加病人心率，延緩疾病進展[1]。經吉林省中醫藥科學院藥理室試驗研究表明：灌胃增率復脈顆粒(0.25～2g/kg)可明顯抑制普萘洛爾引起的大鼠心率減慢作用；縮短乙酰膽堿引起的大鼠心動過緩的持續時間；能明顯延長異丙腎上腺素和亞硝酸鈉耐常壓缺氧存活時間；對正常小鼠，亦可明顯延長小鼠耐常壓缺氧死亡時間[2]。本實驗以方中活性成分丹參素轉移率和全方干膏得率為指標，采用HPLC法和正交實驗法，確定了該制劑最佳水提工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10A紫外檢測器(日本島津公司)；AE163電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥

丹參素鈉對照品(批號110855-2014)購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，乙酸乙酯、冰乙酸、氯化鈉為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計[3]

以活性成分丹參素轉移率和全方干膏得率為指標，選用L9(34)正交表對加水量、提取時間、提取次數進行考察。因素和水平見表1，試驗順序見表2。

表1 因素和水平表

2.2 樣品測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm,4.6×250mm)；流動相：乙腈-0.5%乙酸(2：98)；流速：1mL/min，檢測波長：283nm；柱溫：室溫。

2.2.2 樣品溶液的制備

按處方比例稱取各藥材飲片，按表2條件進行提取，合并提取液，濾過，濾液濃縮并定容至250mL，得到9份樣品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備

精密稱取丹參素鈉對照品適量，加50%甲醇制成每1mL含1.2mg的溶液(相當于每1mL含丹參素1.08mg)，即得。

2.2.4 供試品溶液制備與測定

精密吸取“2.2.2”項下九份樣品溶液各50mL，分別加鹽酸2d，再加入氯化鈉5g，搖勻，濾過，吸取濾液各25 mL，用乙酸乙酯提取4次，每次20 mL，合并提取液，回收溶劑至近干，殘渣以50%甲醇溶解，并定容至10 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項下條件，測定并計算丹參素含量及提取率；精密吸取剩余樣品溶液各90mL，平行2份，水浴蒸干，于105℃烘箱干燥至恒重，測定干燥物重量，計算干膏得率，測定結果見表2。

2.2.5 陰性供試品溶液制備

精密吸取缺丹參的陰性樣品溶液 50mL，按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。

2.2.6 專屬性試驗

精密吸取上述對照品溶液、陰性供試品溶液和供試品溶液各 10 μL，按"2.2.1"項下的色譜條件進樣。結果表明，供試品溶液中主要色譜峰得以充分分離，且丹參素峰形良好，陰性對照在丹參素保留時間處無干擾峰出現，見圖 1。

2.2.5 方法學考察

丹參素在23.8～238μg·mL-1范圍內呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=332723.8x+3645.5，r=0.9998；取丹參素鈉對照品溶液重復進樣6次，RSD=0.35%、吸取供試品溶液重復進樣6次，RSD=0.58%，結果高效液相色譜儀精密度良好；分別取供試品溶液，于24h內不同時間重復進樣6次，RSD=0.93%，表明供試品溶液在24h內穩定。

A.丹參素對照品色譜圖；B.供試品色譜圖；C陰性對照色譜圖

圖1 高效液相色譜圖

2.3 結果

2.3.1 正交實驗評分

根據丹參素轉移率和干膏收率，將兩指標綜合加權評分。分別將丹參素轉移率、干膏得率最高結果計為100，并與之比較，依次對9次試驗結果進行綜合評分。將丹參素提取率權重系數設為0.7，將干膏得率權重系數設為0.3，綜合評分=0.7×丹參素轉移率+0.3×干膏得率,結果見表2。

2.3.2 方差分析見表3

表2 正交實驗設計及結果分析

從試驗結果直觀得出，各因素影響順序為C(煎煮次數)>B(煎煮時間)>A(加水量)；從方差分析結果得出，C(煎煮次數)P<0.05，具有顯著性，B(煎煮時間)和A(加水量)不具有顯著性。從生產的實際考察，為了節省工時，節省能源，優選煎煮工藝為A2B3C2，即加10倍量水，煎煮2次，每次2h。

表3 方差分析表

注：F0.05=19.00 F0.01=99.00；“*”表示有顯著性

2.4 工藝驗證實驗

分別稱取50倍量處方藥材，共3份，按照確定的優選工藝條件A2B3C2進行重復驗證，測定結果見表4。

表4 工藝驗證實驗結果

2.5 結論

通過正交實驗優選和工藝驗證，確定了增率復脈顆粒水煮最佳工藝參數為：處方藥材加10倍量水，煎煮2次，每次2h。在此工藝條件進行3次工藝驗證試驗，丹參素轉移率在60%以上，RSD=1.26%，表明該最佳工藝條件是穩定可靠，可用于增率復脈顆粒工藝提取。

3 討論

(1)采用高效液相色譜法測定丹參素含量的文獻報導較多[5-6]，我們曾采用甲醇-冰乙酸-水(5：1：94)、甲醇-0.1%磷酸(10：90)等多種流動相進行分離，供試品中丹參素色譜峰未能得到充分分離；后采用乙腈酸水系流動相試驗，經多次摸索，供試品中丹參素色譜峰得以充分分離，最后確定流動相為：乙腈-0.5%乙酸(2：98)。

(2)曾采用Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×150mm)色譜柱進行試驗，發現丹參素色譜峰與后面雜質峰未能達到充分分離，選用Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250mm)色譜柱，供試品中丹參素色譜峰得以充分分離。

(3) 供試品溶液制備過程中滴加鹽酸，可提高乙酸乙酯萃取效果；加氯化鈉可減少乳化。

[1] 錢 峰，于清華，張曉華，等.于作盈教授治療病態竇房結綜合征經驗[J].中國中醫急癥，2013，22 (10)：1711-1729.

[2] 增率復脈顆粒藥效試驗，本項目研究資料待發表.

[3] 江玲麗，程建明.正交試驗優選宣肺化痰方水提工藝[J].現代中藥研究與實踐，2015，29(5):43-45.

[4] 李全斌，張昌文，吳建萍，等.活血定痛合劑中丹參素和原兒茶醛的含量測定[J].實用藥物與臨床，2014，17(9)：1170-1174.

[5] 李蕓薈.HPLC法測定冠心寧軟膠囊中丹參素的含量[J].天津藥學，2015，27(3)：16-17.

[6] 楊炳火，夏崇才，周芙瓊，等.正交實驗設計優化超聲煎煮法提取丹參中丹參素的研究[J].環球中醫藥，2014，7(12)：926-928.

(本文文獻格式：張大軍，張曉華，王兆華.正交試驗法優選增率復脈顆粒水提工藝[J].山東化工，2016，45(12)：28-30.)

Optimization of Extraction Techenology of Zengmaifulv Granules by Orthogonal Test

Zhang Dajun*,Zhang Xiaohua,Wang Zaohua

(Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China)

Objective：To establish the best decoction technology of Zengmaifulv granules .Methods：Take transport rate of Danshensu and extractive of Chinese herbal decoction pieces as an indecator to determine the extraction process of Zengmaifulv granules. Results：Herbs plus 10 times amount of water to decoct 2times,boiling 2hours every time. Conclusion： The optinized techenology is stable and reliable, can be used tor the extraction of Zengmaifulv granules.

zengmaifulv granules; orthogonal test; HPLC; danshensu

2016-04-18

吉林省中醫藥專題研究項目(20152T22)

張大軍(1964—)，主任藥師，研究方向：中藥新藥與制劑。

TQ461

A

1008-021X(2016)12-0028-03