大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926內皮細胞的保護作用及機制

萬　強，楊玉萍，劉中勇（江西中醫藥大學附屬醫院.心血管病科、.肺病科，江西南昌　330006）

大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926內皮細胞的保護作用及機制

萬強1，楊玉萍2，劉中勇1
（江西中醫藥大學附屬醫院1.心血管病科、2.肺病科，江西南昌330006）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.038.html

目的探討PM2.5對EA.hy926型人臍靜脈內皮細胞損傷的影響及大蒜素的保護作用及機制。方法采集大氣PM2.5分別以20、200、400 mg·L-1染毒EA.hy926細胞24 h，MTT法測細胞存活率；流式細胞術測細胞凋亡；Western blot法測p-ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白水平；ELISA法測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）含量，并測細胞丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脫氫酶（LDH）活性；分別加入大蒜素（5、20、40 mg·L-1）和ERK1/ 2通路特異性阻滯劑PD98059 20 μmol·L-1，檢測大蒜素的干預作用及機制。結果與對照組比較，PM2.5染毒后呈劑量依賴性降低EA.hy926細胞存活率，上調p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促進細胞凋亡，誘導分泌TNF-α及IL-6含量增高，降低SOD活性，增加MDA含量及LDH活性（P＜0.05）；大蒜素呈劑量依賴性增加EA.hy926細胞的存活率，下調p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制細胞凋亡，降低TNF-α及IL-6含量，增加SOD活性，降低MDA含量及LDH活性（P＜0.05）。結論大蒜素可能通過抑制ERK1/2信號通路，減輕PM2.5誘導的炎癥反應及氧化應激損傷，從而保護EA.hy926細胞。

PM2.5；大蒜素；ERK1/2信號通路；EA.hy926內皮細胞；炎癥反應；氧化應激損傷

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變是心血管疾病的重要病理基礎，其發病機制尚未完全明確。在AS病變過程中，從脂質條紋、纖維斑塊和粥樣斑塊，到不穩定斑塊的破裂及血栓形成，炎癥反應及氧化應激損傷始終貫穿其中［1］。血管內皮細胞損傷被視為AS始動病理環節，受損的內皮細胞在炎癥和氧化應激刺激下可吸附單核細胞，吞噬脂質成為成泡沫細胞，形成脂質斑塊，使動脈管腔狹窄，管壁失去彈性形成AS［2］。PM2.5是大氣中空氣動力學直徑≤2.5 μm的細顆粒物，也稱可入肺顆粒物。研究表明，吸入PM2.5可加重炎癥反應和氧化應激損傷而促進AS形成及發展。長期暴露在PM2.5環境可抑制載脂蛋白E基因敲除小鼠血漿高密度脂蛋白的抗炎能力，并明顯增加肝臟丙二醛（malonaldehyde，MDA）和核轉錄因子Nrf2調控的抗氧化應激相關基因表達，而促進AS形成［3］。

大蒜素（allicin）是從蔥科蔥屬植物大蒜（Allium Sativum）的鱗莖中提取的一種有機硫化合物，也存在于洋蔥及其他蔥科植物中。既往研究表明，大蒜素可通過抑制炎癥因子分泌、清除自由基抗氧化應激損傷、調節脂質代謝抑制泡沫細胞形成等多途徑發揮抗AS效應［4］，但其機制尚未完全闡明。本實驗觀察PM2.5對EA.hy926型人臍靜脈內皮細胞損傷的影響，加用大蒜素和細胞外信號調節蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）信號通路特異性阻滯劑PD98059干預，探討大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926細胞的干預作用及可能機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株EA.hy926內皮細胞株購自美國ATCC細胞庫，增殖周期約為31 h，批號2922。

1.1.2藥品與試劑大蒜素購自北京索萊寶科技有限公司，純品為無色油狀物，相對分子質量為162，批號150603；二甲基亞砜（DMSO）和噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清和DMEM培養基購自美國Gibco公司；p-ERK1/2、Bcl-2、Bax和β-actin抗體購自美國Cell Signal Technology公司；Annexin V-FITC試劑盒購自美國Bio Vision公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司；MDA、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器ST16R型低溫高速離心機、3111型恒溫細胞培養箱和MK3型酶標儀購自美國Thermo公司；MiniVol型便攜式PM2.5采樣器購自美國Airmetrics公司；165-1801型電泳儀購自美國Bio-Rad公司；石英纖維濾膜購自美國Whatman公司；TY7350型流式細胞儀購自美國ACEA Biosciences公司；IX71型熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2方法

1.2.1PM2.5的采集與制備參照廣州市環保局發布的PM2.5監測數據，于空氣質量指數5級及以上PM2.5嚴重超標的霧霾天氣，在廣州市距離地面約50 m高建筑樓頂用PM2.5采樣器以流量為5 L ·min-1進行24 h·d-1采樣，連續采樣3 d。將石英纖維濾膜剪成1 cm×3 cm大小置于去離子水，超聲震蕩30 min×3次，用6層無菌紗布過濾提取液，以10 000 r·min-1于4℃離心20 min，收集提取物真空冷凍，并干燥成干粉，稱重，-20℃避光保存。加滅菌PBS配制成質量濃度分別為20、200、400 mg· L-1的PM2.5混懸液。

1.2.2細胞分組及處理設PM2.5不同質量濃度組，分別以0、20、200、400 mg·L-1PM2.5作用EA. hy926細胞24 h［5］。藥物干預組設① 對照組；②PM2.5組：PM2.5混懸液200 mg·L-1染毒24 h；③～⑤分別為PM2.5+大蒜素低、中、高劑量組：大蒜素用DMSO溶解并分別以5、20、40 mg·L-1預處理細胞1 h［6］后，再加PM2.5 200 mg·L-1染毒24 h；⑥PM2.5+PD98059組：PD98059 20 μmol·L-1預處理細胞30 min［7］后，再加PM2.5 200 mg·L-1染毒24 h。

1.2.3MTT法檢測細胞存活率EA.hy926細胞密度調至每孔1×104個，接種至96孔培養板，每組設6個復孔，培養24 h后撤去血清。PM2.5混懸液不同質量濃度染毒后加入20 μL MTT溶液（PBS溶解，濃度為5 g·L-1）室溫培養4 h，每孔加150 μL DMSO使還原產物完全溶解，低速振蕩10 min，酶標儀測波長570 nm處各孔吸光度A。細胞存活率/%=［A（實驗組）-A（空白對照組）/A（對照組）-A（空白對照組）］×100%。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡EA.hy926細胞密度調至每孔2×105個接種至12孔培養板24 h，每組設6個復孔，加不含血清的培養液培養24 h。收集細胞，PBS洗滌5 min×2次，加Annexin V-FITC 及PI雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.5EA.hy926細胞TNF-α、IL-6及MDA含量、SOD、LDH活性的測定取對數生長期的EA.hy926細胞以1×108·L-1接種于培養皿。收集細胞，以1 000 r·min-1離心10 min，去除培養液，以2 mL PBS洗1次后，加PBS 500 μL混懸。超聲5 s×5次，使細胞破碎，黃嘌呤氧化酶法檢測細胞裂解液中SOD活性。收集細胞上清液，ELISA法檢測TNF-α 及IL-6含量，硫代巴比妥法檢測MDA含量，比色法檢測LDH活性，操作步驟參照說明書進行。

1.2.6Western blot法檢測Bax、Bcl-2、p-ERK1/2蛋白水平提取EA.hy926細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣品煮沸5 min后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，加一抗于4℃反應過夜，洗膜3次，加二抗于室溫結合，化學發光檢測。以β-actin做內參蛋白，Quantity One軟件分析各條帶吸光度。

1.2.7統計學處理用SPSS 13.0軟件分析數據，數據采用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni法。

2　結果

2.1PM2.5對EA.hy926細胞的影響

2.1.1對EA.hy926細胞存活率的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯降低EA.hy926細胞存活率（P＜0.05），見Tab 1。

2.1.2對EA.hy926細胞凋亡的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯誘導EA.hy926細胞凋亡（P＜0.05），見Tab 1。

2.1.3對EA.hy926細胞TNF-α、IL-6及MDA含量、SOD、LDH活性的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯降低EA.hy926細胞內SOD活性（P＜0.05），明顯增加細胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性（P＜0.05），見Tab 1。

2.1.4對EA.hy926細胞內Bax、Bcl-2及p-ERK1/2蛋白水平的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯增加EA.hy926細胞內Bax 及p-ERK1/2蛋白水平，并明顯減少Bcl-2蛋白水平，增加Bax/Bcl-2蛋白比率（P＜0.05），見Fig 1。

2.2大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926細胞的干預作用

2.2.1對PM2.5降低EA.hy926細胞存活率的干預作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol·L-1PD98059對于PM2.5降低EA.hy926細胞存活率均有明顯的拮抗作用（P＜0.05），見Tab 2。

2.2.2對PM2.5誘導EA.hy926細胞凋亡的干預作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol·L-1PD98059均可明顯減少由PM2.5誘導的EA.hy926細胞凋亡（P＜0.05），見Tab 2。

Tab 1　Effects of different concentrations of PM2.5 on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

Tab 1　Effects of different concentrations of PM2.5 on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

*P＜0.05 vs control group

Group　Viability/%　Apoptosis/%　TNF-α/ng·L-1　IL-6/ng·L-1　MDA/μmol·L-1SOD/kU·L-1　LDH/kU·L-1Control　100　2.07±0.33　162.75±14.31　348.45±15.48　1.21±0.36　18.12±0.93　0.63±0.04 20 mg·L-1　98.71±0.57　2.10±0.36　164.51±13.92　351.34±15.96　1.23±0.39　18.09±1.08　0.63±0.05 200 mg·L-1　82.37±3.36*　21.35±0.87*　352.33±15.63*502.73±17.16*　4.27±0.45*　11.64±0.78*　1.05±0.05*400 mg·L-1　63.42±3.69*　42.07±1.62*　408.20±16.77*564.59±18.03*　5.46±0.42*　8.43±0.63*　1.45±0.05*

Tab 2　Effects of different concentrations of allicin on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

Tab 2　Effects of different concentrations of allicin on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

The concentration of PM2.5 was 200 mg·L-1.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group

Group　Viability/%　ApoptosisTNF-αIL-6MDASODLDH /%/ng·L-1/ng·L-1/μmol·L-1/kU·L-1/kU·L-1Control　100　2.05±0.36　162.43±14.04　349.56±15.42　1.22±0.36　18.15±0.96　0.63±0.04 PM2.5　82.35±3.33*　21.37±0.84*　353.42±15.75*　504.52±17.07*　4.26±042*　11.59±0.84*　1.05±0.04*PM2.5+allicin 5 mg·L-1　82.41±3.42*　21.30±0.75*　351.23±16.02*　502.46±15.72*　4.22±0.39*　11.62±0.78*　1.05±0.05*PM2.5+allicin 20 mg·L-1　87.92±3.15*#　15.16±0.84*#303.30±17.76*#448.02±14.61*#　3.28±0.45*#　14.63±0.93*#　0.94±0.06*#PM2.5+allicin 40 mg·L-1　91.32±2.13*#　11.72±0.66*#242.18±16.74*#388.15±15.33*#　2.21±0.33*#　16.90±0.84*#　0.75±0.05*#PM2.5+PD98059 20 μmol·L-186.84±3.09*#　16.96±0.63*#322.69±18.06*#462.64±16.08*#　3.39±0.48*#　13.98±0.81*#　0.96±0.05*#

Fig 1　Effects of different concentrations of PM2.5 on protein levels of p-ERK1/2，Bax and Bcl-2 in EA.hy926 cell（±s，n=3）

2.2.3對PM2.5影響EA.hy926細胞TNF-α、IL-6 及MDA含量、SOD、LDH活性的干預作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol· L-1PD98059均可明顯增加EA.hy926細胞內SOD活性，明顯降低細胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性（P＜0.05），見Tab 2。

2.2.4對PM2.5影響EA.hy926細胞內Bax、Bcl-2及p-ERK1/2蛋白水平的干預作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol·L-1PD98059均可明顯降低EA.hy926細胞內Bax及p-ERK1/2蛋白水平，并明顯增加Bcl-2蛋白水平，減少Bax/ Bcl-2蛋白比率（P＜0.05），見Fig 2。

Fig 2　Effects of different concentrations of allicin on protein levels of p-ERK1/2，Bax and Bcl-2 in EA.hy926 cell（±s，n=3）

3　討論

PM2.5主要來源于汽車尾氣、石化燃料燃燒及香煙煙霧等，可長時間停留于大氣中。PM2.5粒徑小，富含大量有害有毒化學物質、細菌、病毒可經呼吸通過黏附作用穿過細胞膜迅速擴散至整肺，通過肺氣血屏障進入毛細血管并滲透到血細胞內，擴散到心血管，隨著循環系統擴散至微血管，作用于血管內皮。多中心、多種族臨床對照試驗證實，長期慢性暴露在高濃度PM2.5環境中，可通過炎癥反應、氧化應激、交感神經興奮性增加等機制，增加動脈內膜中層厚度、降低AS斑塊穩定性，促進此人群AS的形成及發展［8-9］。動物研究亦發現接觸高濃度PM2.5可上調清道夫受體CD-36的表達，誘導粥樣斑塊內巨噬細胞內膽固醇堆積；促進炎癥及氧化應激反應，增加內臟脂肪素表達，加速易損斑塊的不穩定及破裂等，進而促進AS的形成［10-11］。

氧化和抗氧化系統之間的平衡是維持內皮細胞功能的關鍵因素。SOD是細胞內的抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子，減輕活性氧（reactive oxygen species，ROS）損害，從而保護內皮細胞，其活性的高低可反映機體抗氧化損傷能力。脂質在自由基作用下可發生過氧化反應，其不飽和脂肪酸氧化終產物為MDA，可引起核酸及蛋白質等生命大分子交聯聚合，產生細胞毒性，MDA含量的高低可反映內皮細胞氧化損傷的嚴重程度。LDH存在于內皮細胞，當細胞受損時，細胞膜結構和細胞質內氧依賴性酶受到影響，細胞膜通透性增加，細胞外液LDH漏出量相應增加，因此LDH含量的高低可反映內皮細胞損傷程度。炎癥反應可損傷內皮細胞，并促進AS發生及進展，其病理特征是在血管內皮，通過炎癥信號途徑完成炎癥因子及黏附因子的釋放，使炎性細胞浸潤，并激活進一步級聯式炎癥反應［12］。TNF-α及IL-6在AS慢性炎癥中扮演了重要角色，對巨噬細胞、單核細胞的遷移和激活起了調控作用，并能促進血管平滑肌細胞增殖，從而參與 AS形成［13］。在Bcl-2基因家族蛋白中，促凋亡基因蛋白Bax和抑凋亡基因蛋白Bcl-2，Bax/Bcl-2比值的高低對細胞凋亡起了直接的調控作用［14］。本研究顯示PM2.5染毒EA.hy926細胞后，可明顯降低細胞內SOD活性，增加細胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性，明顯降低EA.hy926細胞存活率、增加細胞內Bax/Bcl-2蛋白比率以促進細胞凋亡，證實PM2.5可通過氧化應激損傷及炎癥反應途徑誘導EA. hy926細胞損傷。

炎癥反應及氧化應激損傷均可激活細胞內的細胞凋亡信號級聯通路以誘導細胞凋亡。ERK1/2通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）家族分支之一，在構建細胞骨架、維持細胞形態、調節細胞增殖及凋亡等生物學進程中起了重要作用，該通路的激活可通過增加血管平滑肌細胞增殖及炎性因子浸潤等促進AS形成［15］。本研究顯示PM2.5染毒可明顯增加EA.hy926細胞內p-ERK1/2蛋白水平，證實PM2.5誘導EA.hy926細胞損傷可能與激活ERK1/2通路有關。

大蒜素可通過抑制核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路降低C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）分泌而抑制炎癥反應；清除ROS而抗氧化應激損傷；抑制膽固醇合成途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA還原酶）活性，阻斷脂質過氧化而調節脂質代謝；抑制粥樣斑塊中巨噬細胞對低密度脂蛋白的降解及吸收，減少泡沫細胞的形成等多途徑發揮抗AS作用［16-18］，但大蒜素是否可通過抑制ERK1/2信號轉導通路，減輕PM2.5誘導的內皮細胞損傷而抗 AS尚不清楚。PD98059可抑制ERK的上游激酶，并與非活化形式的MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）結合以抑制MKK的激活與磷酸化，發揮特異性阻斷ERK1/2信號通路的作用。本研究結果證實，與PM2.5組比較，大蒜素及PD98059均可不同程度拮抗PM2.5降低EA.hy926細胞存活率、降低Bax/Bcl-2基因蛋白比率以抑制EA.hy926細胞凋亡、降低EA.hy926細胞內p-ERK1/2蛋白水平、增加EA.hy926細胞內SOD活性，降低細胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性，提示大蒜素抗AS機制之一可能是通過抑制ERK1/2信號通路，減輕PM2.5誘導的氧化應激損傷及炎癥反應，從而保護血管內皮細胞，此發現有望為大蒜素在AS防治中的應用提供新依據。大蒜素的抗AS作用機制及臨床應用仍需進一步基礎實驗及臨床研究得以明確。

（致謝：本實驗主要在江西中醫藥大學的國家中藥臨床藥理研究基地完成，感謝各位老師對本實驗的幫助和指導。）

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hy926 endothelial cell injury induced by PM2.5 and its mechanism may be related to the attenuations of inflammation and oxidative stress via the inhibition of ERK1/2 pathway.

Allicin prevents EA.hy926 endothelial cell injury induced by PM2.5 via inhibiting ERK1/2 pathway

WAN Qiang1，YANG Yu-ping2，LIU Zhong-yong1
（1.Dept of Medical Cardiology，2.Dept of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330006，China）

AimTo investigate the protective effect of allicin against EA.hy926 endothelial cell injury induced by PM2.5 and the possible mechanism.MethodsThe samples of fine particulate matter（PM2.5）were collected and made into suspension.Different concentrations of PM2.5（20，200，400 mg·L-1）were added to EA.hy926 cell.The viability and apoptosis of EA.hy926 cell，the protein levels of p-ERK1/ 2，Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cell，the contents of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6），and malonaldehyde（MDA），the activities of superoxide dismutase（SOD）and lactic dehydrogenase（LDH）in the EA.hy926 cell culture supernatant were measured by MTT assay，flow cytometry，Western blot，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and colorimetry，respectively.Allicin at different concentrations（5，20，40 mg·L-1）or a specific inhibitor of ERK1/2 signaling pathway PD98059（20 μmol· L-1）was added into the EA.hy926 cell to observe the effect of allicin.ResultsCompared with control group，PM2.5 significantly increased the apoptosis，the contents of TNF-α，IL-6 and MDA，the activity of LDH，the protein levels of p-ERK1/2 and Bax/Bcl-2 ratio，but decreased the viability and SOD activity inthe EA.hy926 cell（P＜0.05）.Compared with PM2.5 group，allicin significantly decreased the apoptosis，the contents of TNF-α，IL-6 and MDA，the activity of LDH，the protein levels of p-ERK1/2 and Bax/Bcl-2 ratio，but increased the viability and SOD activity in the EA.hy926 cell（P＜0.05）.ConclusionAllicin displays a significant protective effect against EA.

PM2.5；allicin；ERK1/2 signaling pathway；EA.hy926 cell；inflammation；oxidative stress

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.019

A

1001-1978（2016）05-0692-06

R284.1；R122.7；R322.123；R329.25；R364.5；R392.12；R543.5

2015-12-25，

2016-01-27

國家自然科學基金資助項目（No 81460680）；江西省科技計劃項目（No 20135BBG70002）

萬強（1985-），男，博士，醫師，研究方向：心血管疾病的臨床及實驗，通訊作者，E-mail：wanqiang109559140@ 163.com