一株聯(lián)產(chǎn)L-精氨酸和聚羥基丁酸酯的重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建

秦敬儒，徐美娟，張顯，楊套偉，許正宏，饒志明（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

一株聯(lián)產(chǎn)L-精氨酸和聚羥基丁酸酯的重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建

秦敬儒，徐美娟，張顯，楊套偉，許正宏，饒志明*
（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

Corynebacterium crenatum SYPA 5-5是一株用于L-精氨酸（Arg）生產(chǎn)的工業(yè)菌株。聚羥基丁酸酯（PHB）是在細(xì)菌內(nèi)部形成的聚合物，將PHB代謝途徑引入細(xì)胞內(nèi)可影響胞內(nèi)的全局代謝網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)聯(lián)產(chǎn)PHB和相關(guān)化工產(chǎn)品如琥珀酸、L-谷氨酸和L-色氨酸等。采用基因工程技術(shù)，將來源于Ralstonia eutropha H16的PHB合成基因簇phbCAB導(dǎo)入到L-精氨酸生產(chǎn)菌株C. crenatum SYPA 5-5中，進(jìn)行組成型表達(dá)，旨在獲胞內(nèi)產(chǎn)PHB、胞外產(chǎn)L-精氨酸的效果，對(duì)出發(fā)菌和重組菌分別進(jìn)行5 L容積發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，并對(duì)發(fā)酵相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明，由于PHB合成基因簇的導(dǎo)入，重組菌中PHB質(zhì)量為細(xì)胞干質(zhì)量的12.8%，實(shí)現(xiàn)了胞外產(chǎn)L-精氨酸、胞內(nèi)產(chǎn)PHB的效果，并發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)PHB的積累對(duì)菌體生產(chǎn)L-精氨酸有一定的正向作用，發(fā)酵96 h，L-精氨酸的產(chǎn)量達(dá)到43.21 g/L，相比于出發(fā)菌提高了20%。

L-精氨酸；聚羥基丁酸酯；鈍齒棒桿菌；聯(lián)產(chǎn)；發(fā)酵

L-精氨酸是一種含有胍基的堿性氨基酸，是生物體尿素循環(huán)中重要的代謝產(chǎn)物，具有獨(dú)特的生理和藥理作用［1］，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品行業(yè)［2-3］。近年來精氨酸生產(chǎn)備受關(guān)注，發(fā)酵法生產(chǎn)精氨酸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［4］。聚羥基脂肪酸酯（PHAs）是原核微生物在碳、氮營(yíng)養(yǎng)失衡的情況下作為碳源和能源貯存而合成的一類熱塑性聚酯。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PHA至少有125種不同的單體結(jié)構(gòu)，并且還在不斷地發(fā)掘出新的單體；而聚-β-羥基丁酸酯（PHB）是PHA中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一種，由于其具有良好的生物可降解性和生物相容性，可用來制作可降解容器及手術(shù)縫合線等，目前已經(jīng)初步進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段［5-6］。Corynebacterium crenatum SYPA 5-5是作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高產(chǎn)L-精氨酸的突變菌株［7］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，將PHB代謝途徑引入細(xì)胞內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)PHB和相關(guān)化工產(chǎn)品的聯(lián)產(chǎn)，如琥珀酸、L-谷氨酸和L-色氨酸等，提高了底物利用率。在E.coli中PHB質(zhì)量可達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上，但在棒桿菌中，PHB的含量則相對(duì)較低。由于PHB在胞內(nèi)的積累，菌株生產(chǎn)相應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量都有所提高［8-10］。

在本研究中，以C.crenatum SYPA 5-5這一L-精氨酸生產(chǎn)菌株作為研究對(duì)象，將來源于Ralstonia eutropha H16的PHB代謝途徑引入菌體內(nèi)，以期得到胞外產(chǎn)L-精氨酸、胞內(nèi)產(chǎn)PHB的效果，其代謝途徑如圖1所示。經(jīng)一系列的研究，觀察PHB代謝途徑的引入對(duì)宿主及L-精氨酸產(chǎn)量的影響。

圖1　細(xì)胞內(nèi)聯(lián)產(chǎn)L-精氨酸與PHB代謝途徑Fig.1　Metabolic pathways of co-producing L-arginine and PHB in the cells

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒鈍齒棒桿菌Corynebacterium crenatum SYPA 5-5，質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB，均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pDXW-10，由江南大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王小元教授研究室惠贈(zèng)。

1.1.2試劑限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、BglII、Hind III，T4DNA連接酶，DL2000 DNA Marker，λ-Hind III digest DNA Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品；乙酰輔酶A，NADH，NADPH，乙酰乙酰輔酶A，3-羥基丁酰輔酶A（3HB-CoA），5，5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸，DTNB），β-羥酰CoA脫氫酶，氨芐青霉素，卡那霉素，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，上海生工生物公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：一水合葡萄糖50 g/L，硫酸銨20 g/L，酵母提取物12 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，去離子水配置，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：一水合葡萄糖200 g/L，硫酸銨18 g/L，酵母提取物12 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀1 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水合硫酸亞鐵0.02 g/L，一水合硫酸錳0.02 g/L，去離子水配置，pH 7.0。將發(fā)酵培養(yǎng)基用體積分?jǐn)?shù)50%的氨水調(diào)節(jié)其pH保持在7.0，在121℃下高溫滅菌30 min。

1.1.4主要儀器核酸電泳系統(tǒng)，北京六一儀器廠制造；UVP凝膠成像儀，UVP有限公司（英國(guó)）制造；3K-15型大型冷凍離心機(jī)，1-14型小型離心機(jī)，Sigma公司（德國(guó)）制造；VC130型超聲破碎儀，SONICS公司（美國(guó)）制造；UV-2000型紫外分光光度儀，尤尼科（上海）儀器有限公司制造；5-L發(fā)酵罐，上海寶興生物儀器公司制造；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司制造；SBA-50型生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所研制；安捷倫1100型HPLC，安捷倫科技公司研制；GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司制造。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒與菌株構(gòu)建文獻(xiàn)［11］報(bào)道過的質(zhì)粒pBHR68含有來自于Ralstonia eutropha H16的聚-β-羥基丁酸（PHB）合成操縱子基因phbCAB，采用基因工程技術(shù)，將phbCAB連接到表達(dá)載體pDXW-10，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB，如圖2所示。將重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB以電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化至C.crenatum SYPA 5-5中，于kanr抗性平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到重組鈍齒棒桿菌C. crenatum SYPA 5-5/pDXW-10-phbCAB。

1.2.2酶活測(cè)定將重組菌C.crenatum SYPA 5-5/ pDXW-10-phbCAB與出發(fā)菌株C.crenatum SYPA 5-5分別接種于10 mL含卡那霉素的LBG培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量轉(zhuǎn)接于LBG培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液于4℃10 000 r/min離心10 min，pH 7.0的磷酸鈉緩沖液清洗3次，懸浮在pH 7.0的磷酸鈉緩沖液，超聲波破碎處理制備粗酶液。將30 μL粗酶液加入到酶活力測(cè)定緩沖體系，立即檢測(cè)相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光值的變化［12-13］。具體酶活測(cè)定緩沖體系分別為：

圖2　重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB的構(gòu)建Fig.2　Construction of recombinant pDXW-10-phbCAB

1）β-酮基硫解酶（PhbA）：0.106 mol/L Tris-HCl （pH 7.3），0.67 mmol/L DTT，0.806 mmol/L乙酰CoA，1.88 mmol/L NADH，2.5 U β-羥酰CoA脫氫酶；

2）乙酰乙酰CoA還原酶（PhbB）：25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），0.25 mmol/L MgCl2·6H2O，12.5 mmol/L DTT，6.0 mmol/L NADPH，1.25 mmol/L乙酰乙酰CoA；

3）PHB合成酶（PhbC）：50 μmol/L 3HB-CoA，25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L DTNB。

1.2.3發(fā)酵研究將鈍齒棒桿菌C.crenatum從活化平板上挑取單菌落接種于10 mL含卡那霉素的LBG培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，然后全部轉(zhuǎn)接于150 mL種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h；將上述培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)6%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為30℃，pH為7.0，攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，培養(yǎng)96 h，初始發(fā)酵培養(yǎng)體積為2.5 L。發(fā)酵過程中，溫度與攪拌轉(zhuǎn)速由發(fā)酵罐自動(dòng)控制，pH通過補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)50%氨水維持穩(wěn)定。從第24小時(shí)起，每12 h取樣一次，采用分光光度儀在562 nm下測(cè)定細(xì)胞OD值，葡萄糖用生物傳感分析儀測(cè)定。

1.2.4產(chǎn)物測(cè)定PHB含量用氣相色譜測(cè)定［14-15］。色譜條件如下：毛細(xì)管柱30 m×0.32 mm，色譜柱中固定液為AT.SE-30，檢測(cè)器為FID，柱溫160℃，汽化室與檢測(cè)器的溫度均為250℃，載氣為N2，流速壓力0.1 MPa，進(jìn)樣量2 μL，采用外標(biāo)法定量。采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定發(fā)酵液中各種氨基酸的含量。將菌體培養(yǎng)至指數(shù)期，進(jìn)行電子透鏡分析［16］。

2　結(jié)果與討論

2.1含PHB合成基因簇菌株的構(gòu)建

研究中所用到的質(zhì)粒與菌株如表1所示。

表1　研究中所涉及的菌株與質(zhì)粒Table 1　Strains and plasmids used in this study

質(zhì)粒pBHR68含有來自于Ralstonia eutropha H16的聚-β-羥基丁酸（PHB）合成操縱子基因phbCAB，通過限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI處理pBHR68，得到PHB合成操縱子基因phbCAB，與經(jīng)過BglII和EcoRI處理的表達(dá)載體pDXW-10在T4DNA連接酶的作用下16℃過夜連接，見圖2，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)E.coli JM109中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證并確認(rèn)重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB以電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化至C. crenatum SYPA 5-5中，于kanr抗性平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)顯微鏡檢測(cè)并提取重組質(zhì)粒驗(yàn)證，見圖3，條帶大小正確，即得到重組鈍齒棒桿菌C. crenatum SYPA 5-5/pDXW-10-phbCAB。

圖3　重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB單雙酶切驗(yàn)證Fig.3　Verification of recombinant pDXW-10-phbCAB by single and double enzyme digestion

2.2PHB合成關(guān)鍵酶酶活分析

對(duì)C.crenatum出發(fā)菌與重組菌分別超聲破碎細(xì)胞，并測(cè)定PHB合成關(guān)鍵酶的酶活。由表2可知，在出發(fā)菌C.crenatum SYPA 5-5中，3個(gè)酶的酶活都較低，然而在重組菌C.crenatum SYPA 5-5/ pDXW-10-phbCAB中，PHB合成酶酶（PhbC）活提高了13倍，β-酮基硫解酶（PhbA）和乙酰CoA還原酶（PhbB）也分別提高了29倍和10倍。由此可知，外源導(dǎo)入的PHB合成基因簇在鈍齒棒桿菌中有表達(dá)，且表達(dá)較好。

表2　PHB合成關(guān)鍵酶酶活分析Table 2　Enzyme activities assay of crude PhbC，PhbA and PhbB

2.3菌株電鏡分析

為了更加直觀說明PHB合成基因簇在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)，對(duì)C.crenatum出發(fā)菌與重組菌分別做了電子透鏡分析。見圖4，圖4（a）為C.crenatum SYPA 5-5的電鏡圖，菌體內(nèi)幾乎看不到PHB顆粒，PHB含量很低；然而在圖4（b）重組菌C.crenatum SYPA 5-5/pDXW-10-phbCAB中，可以看到明顯的PHB顆粒存在。由此也進(jìn)一步說明PHB合成基因簇在鈍齒棒桿菌中有較好的表達(dá)。

圖4　C.crenatum SYPA 5-5與C.crenatum SYPA 5-5/ pDXW-10-phbCAB電子透鏡圖Fig.4　TEM pictures of C.crenatum SYPA 5-5 and C. crenatum SYPA 5-5/pDXW-10-phbCAB

2.4鈍齒棒桿菌發(fā)酵研究及發(fā)酵參數(shù)分析

菌體內(nèi)生產(chǎn)L-精氨酸與PHB的代謝途徑如圖1所示，從底物葡萄糖出發(fā)，一方面，經(jīng)過EMP、TCA循環(huán)，再經(jīng)ArgC—H等一系列L-精氨酸合成酶，最終到產(chǎn)物L(fēng)-精氨酸；另一方面，經(jīng)EMP形成公共前體乙酰輔酶A，然后經(jīng)過PHB合成3個(gè)關(guān)鍵酶β-酮基硫解酶（PhbA）、NADPH依賴的乙酰輔酶A還原酶（PhbB）和PHB合成酶（PhbC）的分別作用，最終得到產(chǎn)物PHB。

對(duì)C.crenatum出發(fā)菌與重組菌分別活化，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，再接種到5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣并檢測(cè)菌體OD值和發(fā)酵液中殘?zhí)呛浚瑱z測(cè)發(fā)酵液中L-氨基酸含量與菌體中PHB含量，結(jié)果如圖5所示。可知，由于PHB合成基因簇在菌體內(nèi)有很好的表達(dá)，相比于出發(fā)菌，重組菌中PHB含量提高了4倍，占細(xì)胞干質(zhì)量的12.8%。整個(gè)分批發(fā)酵過程中，初始葡萄糖質(zhì)量濃度相同，重組菌生長(zhǎng)更快，同時(shí)糖耗速度更快，發(fā)酵至96 h葡萄糖耗盡，而出發(fā)菌的葡萄糖質(zhì)量濃度剩余量為15 g/L，分批發(fā)酵至103 h結(jié)束（圖中未顯示），PHB在細(xì)胞內(nèi)的積累影響到了細(xì)胞的生長(zhǎng)。令人驚喜的是，發(fā)酵至96 h，重組菌中L-精氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了43.21 g/L，比出發(fā)菌增加了20%，然后對(duì)發(fā)酵液中的相關(guān)氨基酸也進(jìn)行了分析，見表3。發(fā)酵液中可檢測(cè)到的氨基酸中，除了Gly產(chǎn)量稍有增加及Arg產(chǎn)量顯著增加外，其他大部分氨基酸產(chǎn)量都有所降低，初始葡萄糖質(zhì)量濃度相同，說明更多的底物或代謝中間物流向L-精氨酸合成途徑。PHB在重組菌胞內(nèi)的積累，賦予了細(xì)胞一定的抗逆性，同時(shí)充當(dāng)細(xì)胞的碳源與能源，國(guó)內(nèi)已有相關(guān)報(bào)道［19］。另外，結(jié)果還顯示，相同時(shí)間內(nèi)菌株生物量更大，菌株消耗更多的底物葡萄糖，公共前體乙酰輔酶A合成量增加，經(jīng)過ArgC—H等一系列L-精氨酸合成酶作用，從而能更好的合成L-精氨酸。這些都說明，胞內(nèi)PHB的積累影響了細(xì)胞整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)。在C. crenatum重組菌中，得到了聯(lián)產(chǎn)L-精氨酸和PHB的效果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PHB在胞內(nèi)的積累對(duì)L-精氨酸的產(chǎn)量有正向促進(jìn)效果。

圖5　C.crenatum SYPA 5-5與C.crenatum SYPA 5-5/ pDXW-10-phbCAB發(fā)酵結(jié)果Fig.5　Fermentation result of C.crenatum SYPA 5-5 and C.crenatum SYPA 5-5/pDXW-10-phbCAB

表3　C.crenatum出發(fā)菌與重組菌發(fā)酵液中氨基酸分析Table 3　Analysis of related amino acids by C.crenatum SYPA 5-5 and SYPA 5-5/pDXW-10-phbCAB

3　結(jié)語(yǔ)

在本課題研究中，采用基因工程手段，在L-精氨酸生產(chǎn)菌株C.crenatum SYPA 5-5中組成型表達(dá)含有PHB基因簇的質(zhì)粒，對(duì)PHB合成關(guān)鍵酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)菌體進(jìn)行電鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)關(guān)鍵酶表達(dá)良好，在5 L的發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵96 h，胞內(nèi)PHB質(zhì)量為細(xì)胞干質(zhì)量的12.8%，出發(fā)菌株里不到3%，而發(fā)酵液中L-精氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到43.21 g/L，比出發(fā)菌株提高了20%；同時(shí)，發(fā)酵液中除L-精氨酸以外的氨基酸含量都有所降低，說明由于PHB代謝途徑的引入，C. crenatum SYPA 5-5的代謝網(wǎng)絡(luò)受到影響，細(xì)胞生長(zhǎng)更快，同時(shí)糖耗更快，實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)產(chǎn)PHB、胞外產(chǎn)L-精氨酸的效果，并且L-精氨酸的產(chǎn)量得到了提升。清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)將PHB代謝途徑導(dǎo)入C. glutamicum中，重組菌中L-谷氨酸的產(chǎn)量在發(fā)酵罐上增加23%［9］；康振等在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了PHB和琥珀酸的聯(lián)產(chǎn)［8］；顧鵬飛等在重組大腸桿菌中表達(dá)PHB合成基因，使L-色氨酸產(chǎn)量有明顯提高［10］。PHB代謝途徑引入菌株，會(huì)影響細(xì)胞全局代謝網(wǎng)絡(luò)，減少相應(yīng)代謝副產(chǎn)物的生產(chǎn)，并提高細(xì)胞的抗逆性［19］。因此，本課題研究中引入PHB代謝途徑到C. crenatum SYPA 5-5中，可作為一種提高L-精氨酸產(chǎn)量的方法。

從本文中圖2可看出，PHB和L-精氨酸的合成過程都需要消耗NADPH，兩者在輔酶水平上存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。因此，接下來的研究工作可從胞內(nèi)輔酶水平著手，并結(jié)合相關(guān)機(jī)理性研討，作進(jìn)一步深入探究。

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Co-Production of L-Arginine and Polyhydroxybutyrate in Recombinant Corynebacterium crenatum

QIN Jingru，XU Meijuan，ZHANG Xian，YANG Taowei，RAO Zhiming*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Corynebacterium crenatum SYPA 5-5 is a industrial strain for L-arginine production. Polyhydroxybutyrate（PHB）is a kind of polymer stored in the bacterial as carbon source and energy. Due to its environment-friendly properties such as biodegradability and biocompatibility，PHB can be made into plastic containers and surgical suture to reduce the white pollution and can be digested easily in the body.It was reported that co-producing PHB and some other industrial valuable compounds，such as succinate，L-glutamate and tryptophan，were possible by introducing PHB metabolic pathways into the cells to influence the intracellular pathways.In this study，a co-produce PHB and L-arginine strain was constructed by introducing the entire phbCAB operon of Ralstoniaeutropha H16 into C.crenatum SYPA 5-5.Fermentation were conducted of the start strain and recombinant one，separately，in a 5-L fermentor and relevant fermentation parameters were detected and analysed.The result showed that intracellular PHB（12.8%of DCW）and extracellular L-arginine （43.21 g/L）were obtained and accumulated in the recombinant strain，.In addition，The PHB production also promote the L-arginine yield，which weas increased by 20%.

L-arginine，polyhydroxybutyrate，Corynebacterium crenatum，co-production，fermentation

Q 78

A

1673—1689（2016）03—0240—07

2014-12-23

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB725202）；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA022102）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300028）。

饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物育種和發(fā)酵代謝方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn