黃酒釀造過程中真菌群落組成及揮發性風味分析

牟穰，毛健*，3，孟祥勇，3，劉蕓雅（1.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；3.國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興312000）

黃酒釀造過程中真菌群落組成及揮發性風味分析

牟穰1，2，毛健*1，2，3，孟祥勇1，2，3，劉蕓雅1，2
（1.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；3.國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興312000）

利用宏基因組學技術對不同發酵時期黃酒醪液中的真菌進行鑒定，并利用GC-MS分析黃酒中的主要高級醇、醛類和酯類等揮發性風味物質。結果表明：黃酒前酵階段真菌有著較高的群落多樣性，在發酵排料當天鑒定出22種真核屬類；其中曲霉屬（Aspergillus）在整個發酵過程相對豐度均達到90%以上，遠遠高于其它真菌，是黃酒發酵過程中的特征微生物；隨著黃酒發酵的進行，優勢真菌呈現先降低后增加趨勢。揮發性風味物質的測定結果表明，在發酵過程中揮發性物質的生成受發酵液性質影響較大，大部分在第4天有著較高的含量，隨著發酵的進行，發酵液的較高酸度和酒精度以及低pH降低了微生物的多樣性，使得揮發性風味物質含量有所降低。關鍵詞：麥曲；發酵醪液；真菌；多樣性；揮發性風味物質

黃酒是我國特有的民族特產，在中國已有數千年的歷史，它主要以谷物（稻米、小米、黍米、玉米等）為原料，加入麥曲、酵母等進行發酵而成。由于原料、地理環境和釀造工藝的不同，不同區域的黃酒均呈現出獨特的風味和口感，按照黃酒風格分為傳統型黃酒、清爽型黃酒和特型黃酒［1］。黃酒發酵過程中存在著復雜的微生物群落，包括細菌以及霉菌、酵母菌等真菌。它們不僅能夠產各種酶類，降解大分子物質，還能夠促進黃酒風味物質的代謝合成，包括有機酸、游離氨基酸、酯類等，賦予了黃酒豐富的營養成分和獨特的風味特征［2-3］。

微生物是黃酒釀造過程中必不可少的組成成分，對微生物群落的解析有助于了解黃酒發酵機理。目前對黃酒微生物的分析大多采用傳統培養方法，但這種方法存在弊端，如采用分離、純化、分子鑒定步驟，需經過一系列繁雜的形態特征和生理生化試驗［4-5］。同時利用培養基方法僅能夠篩選出少量微生物，大部分微生物因不能培養而遺漏，造成檢測的微生物群落結構不準確。

隨著分子生物學技術的發展，越來越多的研究人員使用非純培養的方法和手段對環境微生物進行全面分析，如16SrRNA克隆建庫［6］、條形碼測序［7］以及基因芯片［8］等技術已被廣泛應用于環境微生物多樣性的研究。高通量測序（High throughput sequencing，HTS）是一種全新的測序技術，它能一次進行多個樣品測定，還能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，給研究提供了方便［9］。通量高、快速、低成本等優點，使得該方法一經出現就被廣泛應用于各種生態系統中，比如土壤［10］、草魚腸道［11］、海洋沉積物［12］等生態環境中微生物多樣性的檢測和研究中。近年來，HTS也逐漸應用到傳統發酵食品中微生物的多樣性研究，如泡菜［13］、干酪［14］、白酒［15］、豆瓣醬［16］等發酵食品，而應用于黃酒中的真菌研究還未見報道。

已發表的有關黃酒微生物的研究主要針對細菌，對于發酵液中的真菌研究較少。然而，真菌在黃酒釀造過程中能產生大量酶類，對黃酒發酵起到十分重要的作用。為探明發酵過程中發酵液風味物質及理化指標的代謝規律，解析黃酒麥曲及發酵醪液中真菌的群落結構，采用宏基因組學對海派清爽型黃酒（上海金楓黃酒）釀造用麥曲和發酵過程中的真菌群落結構進行分析，同時對發酵液風味物質及理化指標進行測定，旨在為解析黃酒釀造過程提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗樣品

黃酒發酵醪液，取自上海金楓酒業股份有限公司，樣品發酵天數分別為0、2、4、6、9、12、18 d和24 d，0 d表示投料當天；黃酒生麥曲，取自企業麥曲倉庫，為2014年生產。所有樣品當天采集完后放入-20℃冰箱保存備用。

1.2樣品宏基因組DNA提取

稱取不同天數發酵醪液和麥曲樣各1 g，采用玻璃珠破碎法對樣品進行破碎處理，用Soil DNA kit試劑盒（OMEGA，Bio-Tek，USA）對樣品進行宏基因組DNA提取，提取方法按說明書進行。

1.3目的區段擴增及高通量測序

擴增選取真菌18S rRNA基因中的ITS1F-ITS2區段作為擴增對象，采用引物ITS1F：CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA和2043R：GCTGCGTTCTTCATC GATGC進行擴增［17-18］。此外，用于PCR擴增的正向引物前加入一段由7個堿基構成的barcode序列，所有樣品分別用不同barcode序列進行區分，具體擴增體系及程序如下。

1.3.1PCR反應體系PCR試驗采用Trans Gen AP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase （Trans Gen Biotech，China）；共20 μL的反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物各（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，模板DNA 10 ng，剩余的用ddH2O補足至20 μL。

1.3.2PCR擴增程序PCR儀采用ABI Gene Amp○R 9700（Applied Biosystems，USA），其反應參數為：1）1×（95℃3 min）；2）30×（95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s）；3）72℃延伸10 min。得到的PCR產物經2 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina雙末端測序分析。

1.4黃酒發酵醪液揮發性風味物質測定

采用頂空固相微萃取技術（HS-SPME）與GCMS相結合測定黃酒發酵醪液中的揮發性物質。

1.4.1HS-SPME條件取4 mL稀釋后的黃酒發酵液，加入到20 mL的頂空瓶中，加1.0 g NaCl和20 μL內標（2-辛醇，質量濃度為8 800 μg/L），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，50℃預熱15 min，萃取吸附40 min，250℃解吸7 min，用于GC-MS分析。

1.4.2 GC條件色譜柱TG-WAXMS（30 m×0.25 μm× 0.25 mm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），不分流，體積流量為1.0 mL/min；進樣口溫度250℃；程序升溫，起始溫度40℃，保持3 min，以6℃/min的速率升溫至100℃，然后以10℃/min升溫至230℃，保持7 min。

1.4.3MS條件離子化方式EI；發射電流50 μA；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；掃描質量范圍33～400 u。

1.4.4物質的定性分析未知化合物的質譜通過與NIST05a.L Database（Agilent Technologies Inc）進行比對，并通過計算保留指數（RI）和查閱已經報道文獻中相應物質RI確認。物質的定量分析采用半定量分析。

1.5黃酒醪液理化指標測定

黃酒醪液中氨基酸態氮、總酸及pH測定方法參照與黃酒相關的國家標準［1］。

1.6數據分析

用Mothur軟件包以97%為劃定閾值對序列劃分操作分類單元（OTU）；利用得出的OTU結果計算樣品中微生物的α-多樣性，包括Chao 1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數等。此外，為盡量減少錯誤測序，確保測序質量，在測序前需要將各序列的引物和barcode去掉，并對序列長度進行篩選［12］。刪掉長度小于50 bp的序列，以及含有其他不明確的堿基（如N）和含有同聚體的區段（重復次數大于6）。試驗結果均采用均值±標準差的形式。

2　結果與分析

2.1宏基因組DNA提取

采用玻璃珠破碎法對樣品進行破碎處理后，提取樣品中微生物的宏基因組，用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結果如圖1所示。

圖1　黃酒發酵醪液及麥曲微生物宏基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoresis of metagenomic DNA extracted from ferment mash and wheat koji

從圖1可以看出，玻璃珠破碎細胞提取宏基因組DNA時產生了很多不同大小的片段，造成電泳時的彌散拖尾現象。但在靠近圖譜上方有著較為清晰的目的條帶，幾乎能保持在同一水平，說明樣品中目的DNA被提取出，可以進行下一步的切膠回收實驗。從圖譜中還可以看出，隨著發酵的進行，亮度有所降低，這說明微生物多樣性隨著發酵的進行而降低。

2.2序列及α-多樣性分析

對不同發酵期的麥曲（9個樣品）進行測序后共獲得179 330條序列，平均每個樣品獲得19 926條序列。樣品的多樣性指數結果見表1。

從表1可以看出，麥曲的Shannon指數最高，達到1.42，是發酵投料當時的4.5倍，是發酵第24天時的35.5倍；從Simpson指數來看，發酵液樣品均達到0.9以上，而麥曲僅為0.4，表明麥曲中的微生物多樣性要高于發酵期間醪液中的微生物多樣性。同時從Coverage指數來看，每個樣品的數值均達到0.999以上，說明利用HTS技術對麥曲及發酵液進行高通量測序得到的數據準確可靠。

從表1中OTU數量可以看出，黃酒麥曲及投料當天的發酵液中真菌多樣性較為復雜，分別達到39種和33種，而隨著發酵的進行，發酵醪液中微生物種類呈遞減趨勢，微生物多樣性越來越低，發酵醪液中真核群落變得更加簡單。這是由于真菌大部分都是好氧菌，貯存期間麥曲與空氣充分接觸，同時麥曲中含有充足的營養物質，使麥曲中的微生物能夠充分生長，因此顯示出較高的微生物多樣性。

表1　樣品多樣性指數Table 1　Alpha-diversity of samples

在黃酒發酵啟動后，由于營養物質的消耗，以及發酵產生的CO2使得微生物處于缺氧的環境，同時發酵液中微生物產生的代謝產物改變了發酵醪液的理化特性，如pH降低、酒精度升高等，這些都對真菌生長產生抑制作用，從而降低了真菌的多樣性。

2.3發酵過程中真菌群落結構

對黃酒麥曲、前酵開始階段（0、2 d）和后酵開始階段（6 d）發酵液中的真菌群落組成進行鑒定分析（表2）。結果表明，在黃酒麥曲中一共鑒定出16種不同的真核屬類，其中相對豐度大于1.00%的有5種，分別為曲霉屬（Aspergillus，72.55%），鏈格孢屬（Alternaria，6.00%），嗜熱真菌屬（Thermomyces，2.37%），鐮刀菌屬（Fusarium，1.69%）和附球菌屬（Epicoccum，1.43%）。而前酵開始階段鑒定出22種不同的真菌屬類，數量上相對于麥曲增加了6種。這是由于黃酒投料時真菌不僅由麥曲帶入，加入的米漿水、酒母和釀造器具等也會帶入其他微生物，同時由于發酵初期氧含量比較充足，微生物所處的環境較為適宜，醪液的理化特性還沒有發生很大改變，對真菌生長的抑制作用并不明顯，此時發酵醪液中的微生物多樣性相對復雜。

2.4優勢真菌屬變化情況分析

隨著發酵的進行，優勢真菌呈現先減少后稍有上升的變化趨勢，特別是第2天的真核群落多樣性在整個發酵階段是最低的，真核數量急劇下降到4種（圖2所示）。當黃酒發酵啟動后，微生物開始發酵并釋放代謝產物，其中有些物質是對微生物生長有害的，如酵母菌發酵產生的酒精對自身和其他真菌有著很大的毒害作用，抑制了真菌的生長［19］；同時一些微生物代謝產生的有機酸也使得發酵液酸度增大，像曲霉菌代謝出檸檬酸，細菌中醋酸菌及乳酸菌分別產生的醋酸、乳酸等［20］。微生物在較高酸和酒精度環境中生長受到抑制，使其群落多樣性降低。

表2　黃酒發酵過程中真菌群落組成分布Table2Distributionofeukaryoticmicroorganism communities during rice wine brewing

圖2　不同發酵時期真菌在屬水平上的數目變化情況Fig.2　Changes of the eukaryotic microorganism in different fermentation periods at genus level

到了發酵后期真核種類稍有上升，在第12天時優勢微生物從6種上升到10種；發酵液中特征微生物曲霉屬相對豐度增大，從第9天的98.54%上升到第12天時的99.27%。其他一些糖化真菌也在后酵階段出現，如根霉屬、毛霉屬等。這是由于到了后酵時期整個發酵液溫度下降，酵母和一些細菌代謝活動變緩，而此時的氧氣量相對前酵階段比較充足，一些霉菌能夠在低溫和低酸下存活而不受抑制［21］。像根霉、毛霉等，它們能夠產生淀粉酶、蛋白酶等物質，降解發酵液中殘余物質產生可供代謝的營養物質，如糖類、蛋白質等，微生物利用這些營養物質而生長，重新使得發酵醪液的真菌多樣性增大［22-23］。

2.5發酵液揮發性物質變化情況

利用GC-MS對黃酒發酵過程中的揮發性風味物質進行鑒定，一共得到60種化合物，其中高級醇類12種，酯類化合物34種，醛類化合物7種，其他類如呋喃、吡嗪等共7種，其中主要揮發性物質變化情況如圖3所示。

圖3　發酵液主要揮發性風味物質變化情況Fig.3　Changes of the main volatile flavor compounds in ferment mash

從圖3可以看出，主要高級醇變化趨勢較為一致，在前酵階段均隨著發酵時間進行，含量不斷增加；到了后酵階段，3種高級醇增長變緩，都在第12天時達到最大值，隨后含量稍有降低并保持穩定。主要醛類物質中，苯甲醛含量在整個發酵過程中一直呈現增長趨勢，苯乙醛和壬醛呈現出先增加后降低的趨勢，其中苯乙醛在第2天達到最大值，壬醛含量在第9天達到最大值，隨后隨著發酵的進行，化合物含量維持在較為穩定的狀態。主要揮發性酯類中，己酸乙酯和乙酸乙酯呈現出先增加后穩定的趨勢，而乙酸異戊酯含量在前4 d上升到最大值，在第6天下降后又上升，之后其含量呈降低趨勢。

高級醇是黃酒發酵過程中酵母合成細胞蛋白質的副產物，主要由酵母產生［24］。在黃酒的前酵階段，由于發酵醪液中具有較多的營養物質，適宜的環境使得酵母產生酒精和大量的高級醇；醇被氧化成醛，使得醛類物質相應增加；有機酸和高級醇發生酯化脫水產生酯，使得發酵液中酯類含量增加。到了后期，由于溫度降低，微生物產酸也使得發酵液變成了較高酸度、高酒精度環境，大量微生物生長受到抑制，酵母產酒精能力也受到影響，因此在后酵時產高級醇能力降低，相應的醛類和酯類化合物生成量也就降低了。

2.6發酵液理化指標變化情況

從圖4可以看出，在前酵階段，總酸增加明顯，第4天達到最大值，隨后保持不變；氨基酸態氮呈現出緩慢的增長趨勢；發酵液pH在第4天最低，總體上呈現先降低后穩定的變化趨勢。

圖4　發酵液理化指標變化情況Fig.4　Changes of the physical and chemicalproperties in ferment mash

黃酒中的有機酸主要是乳酸、醋酸和琥珀酸，其中非揮發性的乳酸和琥珀酸是導致黃酒回味的主要物質［25］。由于在發酵前期，充足的養分和空氣，使得產酸微生物大量生長，微生物代謝出大量有機酸，使得發酵液總酸增大，這時候的pH也隨之降低；到了發酵后期，由于發酵液不適合微生物生長，一些產酸微生物生長受到抑制，因而總酸和pH能夠保持較為穩定的狀態。氨基酸主要是由生物合成和轉氨基作用產生，這個過程需要利用微生物產生的酶來合成或轉化。由于大部分合成酶及轉氨酶都是從麥曲中帶入，并且在發酵過程中含量保持較為穩定，因而酶催化產生的氨氮能夠穩定增長。

3　結語

采用宏基因組學的方法分析了清爽型黃酒發酵過程中真菌群落組成，發現在整個黃酒發酵過程中曲霉屬具有較高的相對豐度，并一直以優勢真菌存在于整個黃酒發酵過程中。采用GC-MS對發酵液揮發性風味物質進行測定，結果表明高級醇呈現出先升高后保持穩定的趨勢，醛類和酯類物質大多呈現出先增加后降低的變化規律。在發酵前期，發酵液中含有大量的營養物質，此時的環境適合微生物的繁殖，因而發酵液中微生物不斷生長并保持較高的多樣性和活性，微生物代謝合成的風味物質含量也隨著升高。隨著發酵的進行，由于一些產酸微生物產生大量有機酸，同時酵母發酵產生了酒精，使得發酵醪液變成高酸、高酒精度環境，造成大量的微生物不適應環境而消失或豐度降低。利用宏基因組學技術能夠快速準確地解析黃酒發酵過程中微生物的群落結構，同時跟蹤主要微生物的變化情況，這對于解析黃酒發酵過程中微生物的動態變化以及指導黃酒生產，具有重要的理論意義和實踐價值。

本文主要從屬水平對各種微生物種類及相對豐度進行了研討，主要是對黃酒發酵醪液中的真菌進行鑒定。后續研究中，可對發酵液的理化性質進一步研究，如營養物質分布、溶氧等，為解釋微生物群落結構變化奠定理論基礎。

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Analysis of Fungi Diversity and Volatile Flavor Compounds in Chinese Rice Wine Fermentation Process

MOU Rang1，2，MAO Jian*1，2，3，MENG Xiangyong1，2，3，LIU Yunya1，2
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine，Shaoxing 312000，China）

As the Chinese national specialty，Chinese rice wine has a long history and unique production and fermentation technology，the microbial community and metabolites contribute to the unique flavor during the rice wine brewing.In this study，the metagenome technology was applied to explore the fungi diversity and the GC-MS was used to analyze the volatile flavor compounds in ferment mash of different fermentation periods.The results showed that the ferment mash had higher fungi diversity at the initial stage，22 genera were identified in 0 day.The relative abundance of Aspergillus were all above 90%，which was much higher as compared with other eukaryotic microorganisms during the fermentation process.The advantageous fungi changed obviously，the genera number decreased at first four days and increased later.The analyzed of volatile flavor compounds showed that the generation of volatile substances were greatly influenced by physical and chemical properties of fermented mash.High acidity，alcohol and low pH reduced the fungidiversity，and lowered the contents of volatile flavor compounds.

wheat koji，ferment mash，fungi，diversity，volatile flavor compounds

TS 262.4

A

1673—1689（2016）03—0303—07

2014-11-25

國家863計劃項目（2013AA102203-06）。

毛健（1970—），男，安徽宿州人，工學博士，教授，主要從事食品生物技術研究。E-mail：biaomao@263.net