產堿性淀粉酶重組枯草芽孢桿菌的構建與發酵優化

王靜麗，劉松，堵囯成*，2，陳堅，2（.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫2422；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫2422）

產堿性淀粉酶重組枯草芽孢桿菌的構建與發酵優化

王靜麗1，劉松1，堵囯成*1，2，陳堅1，2
（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫214122）

堿性淀粉酶催化淀粉在堿性環境中高效降解，廣泛應用于紡織退漿、洗滌、制藥等領域。通過信號肽篩選，將來源于嗜堿單胞菌Alkalimonas amylolytica的堿性淀粉酶基因于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600實現分泌表達，并優化了重組菌產酶的發酵條件。在最佳信號肽ywbN介導下，重組B.subtilis發酵51 h，胞外AmyK酶活最高達146.86 U/mL，且能在發酵上清液中檢測到與AmyK理論相對分子質量（60 kDa）一致的蛋白質條帶。通過單因素實驗優化了發酵培養基（糊精32 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO42.32 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L），并在發酵24 h后添加0.2 g/dL Na2CO3調節發酵液pH，發酵72 h胞外AmyK酶活達640.33 U/mL，較優化前提高了336%，是目前已報道重組B.subtilis產堿性淀粉酶的最高水平。研究結果為AmyK發酵生產的工業化提供了數據支撐。

堿性淀粉酶；信號肽；重組枯草芽孢桿菌；發酵優化；碳酸鈉

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）催化淀粉、糖原等分子中α-1，4-糖苷鍵水解，生成糊精、麥芽寡糖、麥芽糖和葡萄糖等產物［1-2］。在堿性條件下，能高效完成上述催化反應的α-淀粉酶即為堿性淀粉酶，一般產自嗜堿微生物，穩定pH范圍為9.0～11.0［3-6］。堿性淀粉酶廣泛應用于紡織退漿、洗滌劑添加、淀粉加工、醫藥生產等領域［7-8］。

通過發酵法高效生產堿性淀粉酶已成為國內外研究者關注的熱點。日本學者Horikoshi［9］首次報道了產自嗜堿芽孢桿菌A-40-2的堿性淀粉酶，此后通過自然環境篩選、物理化學誘變獲得堿性淀粉酶生產菌株的研究陸續報道，但產酶水平有限。隨著分子生物學技術的發展，構建高產重組菌成為提高堿性淀粉酶產量的重要途徑。Murakami［10-11］等分別將來源于芽孢桿菌Bacillus halodurans 38C-2-1和MS-2-5的堿性淀粉酶基因在大腸桿菌Escherichia coli中表達，胞內酶活達10 U/mL和52 U/mL，分別較野生菌提高45倍和104倍。Wang［1］等將來源于嗜堿單胞菌Alkalimonas amylolytica的堿性淀粉酶（AmyK）基因在E.coli表達，胞外酶活達116.75 U/mL。然而，重組菌產酶的總體水平并不高，有待進一步提升。

與其他原核微生物表達系統相比，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis系統具有諸多優勢：僅有單層細胞外膜，分泌信號肽效率高，可將外源蛋白質直接分泌至培養基，提高下游純化效率［12］；廣泛用于多種工業酶的生產，發酵技術成熟［13］；非致病性，被列為國際公認的安全微生物（GRAS）；遺傳背景清楚，質粒和噬菌體載體類型豐富［14］；密碼子偏好性不明顯［15］。

作者所在課題組前期研究中，將AmyK成功于畢赤酵母Pichia pastoris［16］表達，發酵120 h，酶活達600 U/mL，但生產強度較低，僅為5 U/（mL·h）。為進一步縮短AmyK發酵生產的周期，通過篩選信號肽，將AmyK在B.subtilis中表達，并對重組菌的發酵培養基和條件進行了優化。

1　材料與方法

1.1菌株和質粒

B.subtilis WB600，E.coli JM109，pET-22b（+）-amyK［16］，E.coli-B.subtilis穿梭質粒pMA0911-SPs，均為作者所在實驗室保藏；克隆質粒pMD18-T-simple，購于TaKaRa（大連）生物工程有限公司。

1.2培養基

LB培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.0。

TB培養基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，KH2PO42.32，K2HPO4·3H2O 16.43；pH 7.0。

1.3方法

1.3.1AmyK表達載體的構建與轉化以pET-22b （+）-amyK（含AmyK基因編碼序列）為模板，PCR擴增得到AmyK基因，引物見表1。擴增條件為：95℃預變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸2 min，30個循環。將擴增得到的AmyK基因片段與pMD18-T-simple連接，轉化E.coli感受態細胞JM109。涂布平板，37℃培養過夜，提取質粒。

表1　引物序列Table 1　Sequences of primers

用Sal I和BamH I分別雙酶切pMD18-T-simple/amyK和含有不同信號肽的E.coli-B.subtilis穿梭載體pMA0911-SPs，再用TaKaRa DNA Ligation Kit中的連接酶連接，連接過夜后轉化E.coli感受態細胞JM109，通過菌落PCR驗證篩選陽性克隆。挑選陽性克隆于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒進行酶切驗證及測序鑒定。序列測定由上海生工有限公司完成。采用化學轉化法［17］轉化重組質粒至B.subtilis WB600。在含有50 μg/mL卡那霉素（Km）平板上挑選陽性克隆，菌落PCR并酶切驗證。構建成功的重組菌于-80℃甘油管保藏。

1.3.2重組質粒穩定性的測定

1）分離穩定性：挑取重組菌株單菌落，接種至5 mL不含Km的LB培養基中，于37℃培養12 h作為種子液，再按體積分數1%的接種量轉種于另一LB培養基中培養24 h，即得傳20代的菌液。將該菌液稀釋至10-5～10-6，取100 μL涂布于LB平板上，待長出菌落后，從中挑取100個單菌落分別點種在無Km的LB平板和含Km的LB平板上，置于37℃培養12 h后統計平板上的單菌落數，作為傳20代質粒分離穩定性的計算指標。如此每隔24 h按體積分數1%的接種量重新接種培養，直至傳到100代，計算穩定性。

2）結構穩定性：分別取20代、60代、100代的菌液，提取質粒后用Sal I、BamH I雙酶切，驗證目的條帶的存在。

詳見文獻［18］。

1.3.3AmyK的表達和檢測取甘油管保藏菌株在含Km的固體LB平板上劃線，于37℃恒溫培養箱培養過夜，挑取活化后的單菌落接種至LB培養基培養，37℃、200 r/min條件下搖床培養12 h，以體積分數4%接種量接種至發酵培養基，同樣條件下振蕩培養72 h。取一定量發酵液，于4℃，12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液（即粗酶液）測定AmyK酶活。

1.3.4淀粉酶活力測定堿性淀粉酶測定采用DNS法［19］。取0.5 mL可溶性淀粉，0.75 mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.5，20 mmol/L），50℃預熱5 min后，加入0.1 mL適當稀釋的粗酶液，50℃反應5 min。取1 mL反應液加入到1 mL DNS中，混勻，沸水浴15 min，冰浴冷卻后定容至10 mL，540 nm下測定吸光值。根據標準曲線計算酶活。酶活單位的定義：堿性淀粉酶每分鐘降解底物（可溶性淀粉）生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計算）所需要的酶量為一個酶活力單位。

1.3.5菌體生物量的測定利用分光光度計檢測經適當稀釋的菌液在600 nm波長處的吸光度值，即OD600。

2　結果與分析

2.1產AmyK重組菌的構建與表達

參照方法1.3.1構建了分別含有信號肽ywbN、yncM、estA、yweA、amyX、nprE、vpr、yvgO的重組表達載體pMA0911M1、pMA0911J1、pMA0911V1、pMA 0911N1、pMA0911A1、pMA0911E1、pMA0911G1、pMA 0911L4。測序結果顯示，AmyK基因序列完全正確。將重組表達載體分別轉化B.subtilis WB600，構建重組菌株WB11M1、WB11J1、WB11V1、WB11N1、WB11A1、WB11E1、WB11G1、WB11L4，以不帶有AmyK基因的空質粒pMA0911轉化B. subtilis WB600，構成重組菌WB11作為空白對照菌株。不同重組菌于TB培養基37℃，200 r/min搖床培養72 h，結果見圖1。由圖1（a）可知，在信號肽ywbN的介導下，胞外胞內酶活最高，分別為146.86 U/mL、7.69 U/mL，分泌效率達95%，因此ywbN為AmyK分泌表達的最佳信號肽。為了進一步驗證重組菌的發酵結果，對8株重組菌WB11M1、WB11J1、WB11V1、WB11N1、WB11A1、WB11E1、WB11G1、WB11L4和對照菌WB11的胞外上清液進行SDS-PAGE分析，結果見圖1（b），只有WB11M1在60 kDa處有一條清晰的蛋白質條帶，大小與AmyK相對分子質量相符合，與前面酶活測定結果一致。

圖1　不同菌株胞內外酶活比較及胞外上清液SDS-PAGE分析Fig.1　AmyK production in recombinant strains and the SDS-PAGEanalysisofAmyKdistributionin culture supernatants

質粒穩定性分析顯示，重組菌WB11M1連續傳100代后，仍有80%細胞帶有質粒，此外，酶切20代、60代、100代重組菌的質粒，目的條帶均存在，說明pMA0911M1在重組菌中可穩定存在。

2.2重組菌WB11M1發酵條件優化

2.2.1碳源對重組菌生長和AmyK產量的影響按照碳源質量濃度相等的原則，將初始TB培養基中的甘油分別替換為1.2 g/dL的9種碳源（圖2（a）），研究碳源種類對重組菌發酵的影響。以麥芽糖、木糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精為碳源時，菌體生長較好，OD600為20左右，發酵結束pH均為8以上。其他碳源條件下，重組菌OD600僅為10左右，發酵結束pH約為6，幾乎不產AmyK。因此，堿性條件可能有利于重組菌產AmyK。糊精為最適產酶碳源，發酵72 h胞外酶活達295.52 U/mL，比初始培養基提高了101%。

在上述實驗的基礎上，優化糊精質量濃度提高AmyK產量（圖2（b））。糊精質量濃度低于40 g/L時，菌體量和AmyK胞外酶活隨糊精質量濃度的提高而增加。糊精初始質量濃度分別為40 g/L和32 g/ L時，OD600和AmyK胞外酶活達到最大值，分別為34.41，417.36 U/mL。因此，發酵培養基糊精的最佳質量濃度為32 g/L。發酵結束時，糊精初始質量濃度低于40 g/L的發酵液均呈明顯堿性，而糊精初始質量濃度為44 g/L時，發酵液pH較接近7。糊精質量濃度過高引起發酵液pH的下降，可能是導致AmyK產量大幅下降的重要原因。

圖2　碳源對菌體生長和產酶的影響Fig.2　Effect of carbon source on biomass，pH，and AmyK production

2.2.2氮源對重組菌生長和AmyK產量的影響以32 g/L的糊精為碳源，按照含氮質量濃度相等的原則，優化TB培養基中的氮源（圖3（a））。重組菌對安琪酵母的利用效果最好，OD600達到52，蛋白胨、酵母粉其次，OD600為28.08。除以安琪酵母、玉米漿為氮源外，發酵結束pH為8左右。以蛋白胨、酵母粉為氮源，胞外AmyK酶活最高達390 U/mL。安琪酵母雖然適于菌體生長，但不能同時促進菌體產酶。以尿素、玉米漿為氮源時，菌體生長很差，酶活也很低。因此，蛋白胨、酵母粉為產AmyK最適氮源。保證蛋白胨、酵母粉質量的比例為1∶2，優化蛋白胨、酵母粉的質量濃度提高AmyK產量（圖3 （b））。菌體量和AmyK酶活均隨蛋白胨、酵母粉質量濃度的增加先增加后減小，當蛋白胨質量濃度20 g/L，酵母粉質量濃度40 g/L時，OD600最大達35.58；當蛋白胨質量濃度12 g/L，酵母粉質量濃度24 g/L時，胞外酶活最高達400 U/mL。發酵結束pH也隨蛋白胨、酵母粉質量濃度的增加先升高后降低，當蛋白胨質量濃度8 g/L、酵母粉質量濃度16 g/ L時，pH最高8.6。因此，最適產酶氮源為蛋白胨質量濃度12 g/L，酵母粉質量濃度24 g/L。

圖3　氮源對菌體生長和產酶的影響Fig.3　Effect of nitrogen source on biomass，pH，and AmyK production

2.2.3碳酸鈉對重組菌生長和AmyK產量的影響碳源種類優化結果表明，偏堿性的環境可能促進AmyK表達。因此，發酵過程中調控pH有望進一步提高AmyK的產量。目前，Na2CO3作為一種重要的pH調節劑已被廣泛用于pH的調節［20-22］。預實驗表明Na2CO3質量濃度高于0.6 g/dL時，發酵液pH高于9.3，因B.subtilis耐受堿能力差，生物量急劇下降而使AmyK產量很低（結果未顯示）。因此，Na2CO3質量濃度選擇0.1～0.6 g/dL，分別于發酵開始后12、18、24、30 h添加，結果見圖4。于12 h添加Na2CO3，隨著Na2CO3質量濃度增加，發酵結束pH先下降后緩慢上升，OD600無明顯規律，添加Na2CO3未能提高AmyK產量。18 h添加效果同12 h。于24 h添加Na2CO3，隨著Na2CO3質量濃度增加，發酵結束pH緩慢上升，OD600總體逐漸降低，Na2CO3質量濃度為0.6 g/dL時，OD600只有20左右；胞外AmyK酶活先增加后減小，Na2CO3質量濃度為0.2 g/dL時，胞外酶活最高達481.98 U/mL，較優化前提高15%。30 h添加效果同24 h，Na2CO3質量濃度為0.1 g/dL時，酶活最高達460.54 U/mL。根據發酵過程及結果發現，選擇在菌體生長非常快的對數時期（12 h，18 h）添加Na2CO3、提高外部pH并不能提高AmyK的產量，而選擇在菌體生長基本穩定的穩定期（24 h，30 h）添加Na2CO3卻能有效提高AmyK的產量。

Manabe［21］等的研究也表明，外部pH上移可提高B.subtilis產淀粉酶。一般認為，其原因如下：在淀粉酶釋放到培養基之前直接提高其折疊效率和/或穩定性；通過去質子及細胞壁丙氨酸缺失，增加細胞壁的負電性，間接穩定淀粉酶；膜結合絲氨酸蛋白酶HtrA、HtrB活力下降；外部pH上移激活或抑制了相關基因簇，由此引起的次級效應導致淀粉酶產量提高。

圖4　碳酸鈉濃度及添加時間對菌體生長和產酶的影響Fig.4　Effect of Na2CO3concentration and adding time on biomass，pH，and AmyK production

2.2.4接種量對重組菌生長和AmyK產量的影響

接種量直接決定接入發酵培養基的菌體量，因此對菌體生長有一定影響，進而會影響重組菌株的產酶量。研究中針對不同接種量對菌體生長和產酶的影響進行了探索，分析了接種量為體積分數2%、4%、8%、12%、16%時重組菌的發酵情況，結果見圖5。隨著接種量的增加，酶活先增加后減小，接種量為體積分數12%時，酶活最高達640.33 U/mL。

圖5　接種量對菌體生長和產酶的影響Fig.5　Effect of inoculum size on biomass，and AmyK production

3　結語

堿性淀粉酶在堿性環境中可以保持穩定并高效催化降解淀粉，廣泛應用于紡織退漿、洗滌劑添加、淀粉加工、醫藥生產等領域。不同的酶都有其分泌表達的最適信號肽，因此產酶重組枯草芽胞桿菌構建中對信號肽的選擇應引起高度重視。此外，本課題組前期研究中將AmyK分別于E.coli和P. pastoris進行表達，前者酶活只有60 U/mL，后者發酵周期長達120 h［16］。因此，進行酶的異源表達時，宿主的選擇對于達到高發酵水平和高生產強度尤為重要。研究中通過信號肽篩選，將來源于A. amylolytica的堿性淀粉酶基因在B.subtilis中成功實現胞外表達，并優化了發酵培養基成分和發酵液的pH。優化后堿性淀粉酶酶活最高達640.33 U/ mL，比優化前提高了336%，生產強度達到8.9 U/ （mL·h），比其在P.pastoris中提高了78%［16］。上述結果表明，B.subtilis是AmyK的理想表達宿主。此外，發酵過程中添加Na2CO3提高AmyK產量的策略，不僅為重組B.subtilis發酵罐上選擇優化控制策略提供了有效依據，而且為其他酶類的發酵過程優化提供了重要參考。

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Construction and Fermentation Optimization of a Recombinant Bacillus subtilis Producing Alkaline Amylase

WANG Jingli1，LIU Song1，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Alkaline amylase，which could efficiently hydrolyze starch under alkaline conditions，has been widely used in textile desizing field，detergent industry，and pharmaceutical production.In this study，alkaline amylase from Alkalimonas amylolytica（AmyK）was screened through signal peptide and expressed in Bacillus subtilis WB600.The fermentation condition of the recombinant strain was then optimized.The extracellular AmyK activity of the recombinant B.subtilis could reach a maximal level of 146.86 U/mL with 51 h fermentation mediated by ywbN signal peptide.There was a protein band observed in the culture supernatant which was consistent for the theoretical molecular weight of 60 kDa for AmyK.The fermentation medium was optimize via a single factor test and determined as dextrin of 32 g/L，tryptone of 12 g/L，yeast extract of 24 g/L，KH2PO4of 2.32 g/L，andK2HPO4·3H2O of 16.43 g/L with pH regulated by 0.2%w/v Na2CO3after 24 h fermentation.The AmyK activity reached to 640.33 U/mL after 72 h，increasing by 336%when compared with the initial medium，which was the highest yield of alkaline amylase for the reported recombinant B. subtilis strains.This study provided a experimental support for the commercial production of AmyK from fermentation.

alkalineamylase，signalpeptide，recombinantBacillus subtilis，fermentationoptimization，sodium carbonate

Q 813

A

1673—1689（2016）03—0296—07

2014-11-21

國家863計劃項目（2012AA022202，2011AA100905）；教育部長江學者和創新團隊發展計劃項目（IRT1135）。

堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵過程優化與控制、酶工程與技術、代謝工程技術的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn