過量表達枯草芽孢桿菌乙偶姻還原酶提高2,3-丁二醇產量

李秀鵬，楊套偉，徐美娟，張顯，饒志明（江南大學生物工程學院，江蘇無錫）

過量表達枯草芽孢桿菌乙偶姻還原酶提高2,3-丁二醇產量

李秀鵬1，楊套偉2，徐美娟3，張顯4，饒志明*
（江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168是一株安全生產的菌株，但是在2，3-丁二醇（2，3-BD）的發酵過程中，會積累較多的副產物乙偶姻（AC）。乙偶姻還原酶是催化AC合成2，3-BD的關鍵酶。為了提高2，3-BD合成效率，首先將乙偶姻還原酶基因acr克隆到B.subtilis 168，構建了重組菌B.subtilis 168/pMA5-acr。對重組菌進行搖瓶發酵實驗，結果表明，相比出發菌，重組菌的2，3-BD產量和轉化率分別提高28.62%和22.87%，主要副產物AC積累量下降了20.01%。同時，分支路徑的副產物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸，也有不同程度的降低。

乙偶姻還原酶；2，3-丁二醇；乙偶姻；枯草芽孢桿菌

2，3-丁二醇（2，3-Butanediol，2，3-BD），化學式是CH3CHOHCHOHCH3，其結構存在3種立體異構體［1］，分別為L-（+）-、D-（-）-和meso-構型。作為一種重要的化工原料和液體燃料，2，3-BD被廣泛應用于化工、能源、食品及航空航天等多個領域［2］。隨著經濟社會的蓬勃發展和石油等不可再生資源的日益枯竭，2，3-BD逐漸受到世界的關注。由于2，3-BD結構特殊［3］，利用化石原料生產2，3-BD成本高、條件苛刻、過程繁瑣，容易對環境造成污染，并且化石原料日益枯竭，因此化學合成法工業化生產較為困難。微生物轉化法是利用可再生資源生產2，3-BD，既克服了化學法生產的原料問題，又符合綠色化工的要求，因此受到了人們越來越多的關注。通過代謝工程、合成生物學及其集成的方法改造微生物［4］，同時，通過優化發酵條件與分離純化工藝來降低環境污染與生產成本，對我國低碳經濟和循環經濟的建設，具有重要的促進作用和潛在的經濟效益［5］。早在1906年，Harden和Walpole［6］就研究了利用肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneμmoniae）發酵生產2，3-BD；1926年，Donker［7］提出了用多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）發酵生產2，3-BD；1933年，Fulmer等［8］提高了產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）生物合成2，3-BD的水平，并指出了其工業化生產的潛力。2，3-BD高產菌株主要是克雷伯氏菌、產氣腸桿菌和粘質沙雷氏菌［3，9-10］。然而，這些菌株都具有潛在致病性，不符合工業化安全生產的要求。

作者所在實驗室保藏的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168是一株安全生產2，3-BD的菌株，其代謝產生的2，3-BD主要以D-（-）-和meso-兩種構型存在［1］。枯草芽孢桿菌的2，3-BD合成途徑［1，11］如圖1所示，以糖類為底物經丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻（Acctoin，AC）并最終轉化為2，3-BD，此步反應需要NADH的參與［5，9］，同時伴隨著有機酸的合成［12］。乙偶姻還原酶（Acctoin，reductase，ACR）作為一種雙功能酶可催化AC和2，3-BD之間的相互轉化［12］：在弱酸性的條件下，該酶以催化AC向2，3-BD轉化為主，過程中消耗NADH；弱堿性時，該酶則主要催化2，3-BD向AC逆向轉化，該過程生成NADH［13-14］。因此，有機酸副產物如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸的合成會與2，3-BD合成途徑競爭碳源；另外，乳酸和琥珀酸的合成還會消耗NADH［1，11］，這可能會影響AC 向2，3-BD轉化的程度，從而造成AC的大量積累。

圖12　，3-丁二醇代謝路徑Fig.1　Metabolic pathway of 2，3-BD.E；acetoin reductase

以B.subtilis 168作為出發菌，克隆乙偶姻還原酶基因acr，構建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/ pMA5-acr，并對其在弱酸性的條件下進行發酵試驗，研究過量表達ACR對發酵過程中2，3-BD積累的影響，希望能達到2，3-BD提高、AC和相關有機酸減少的目標，為工業化應用打下基礎。

1　材料與方法

1.1菌種與質粒

Bacillus subtilis 168由作者所在實驗室保藏，表達載體pMA5亦由作者所在實驗室保藏。

1.2主要試劑與培養基

工具酶，購自TaKaRa公司；質粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、抗生素、咪唑，購自上海Sangon公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，購自Ferments公司；NADH，NAD+，購自Sigma Aldrich公司；PCR引物，由上海Sangon公司合成；其他試劑均為國產試劑。

活化培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；自然pH值。

種子培養基（g/L）：葡萄糖80，蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；自然pH值。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖140，酵母膏5，KH2PO46，K2HPO4·3H2O 14，尿素5，玉米漿20，檸檬酸鈉8；pH 6.5。

1.3主要試劑配制

A液（50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液）：7.08 g Na2HPO4，加去離子水定容至1 L。

B液（50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液）：5.99 g NaH2PO4，加去離子水定容至1 L。

磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）：將A液和B液按照31.5∶68.5的體積比混勻。

PBS緩沖液（pH 7.0）：NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.626 g/L，用濃鹽酸調至pH 7.0。

1.4乙偶姻還原酶基因acr克隆及表達載體構建

根據NCBI中枯草芽孢桿菌全基因組核酸序列acr的基因序列設計一對引物，見表1，并在引物5′端分別加上BamH I和Mlu I酶切位點（下劃線）。

表1　文中所涉及的引物Table 1　Primers used in the study

提取B.subtilis 168的基因組作為模板，以Forawrd/Reverse引物進行PCR擴增，獲得目的基因片段acr。PCR總反應體系為50 μL，包含1 ng的質粒模板，200 μmol/L dNTP，20 μmol/L引物和1 μL 的ExTaq DNA聚合酶。程序設定為95℃預變性5 min；循環擴增程序為95℃變性50 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s（根據實際情況，時間設定為1 kb/min），35個循環；72℃延伸10 min。PCR反應產物用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶經分離后，用膠回收試劑盒（Takara）回收，回收的基因片段與pMD18-T連接，轉化E.coli JM109，經過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉化子。提取質粒酶切驗證，重組質粒命名為T-acr，DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。經測序驗證正確的重組質粒T-acr，用BamH I和Mlu I雙酶切后連接到經過相同酶切的pMA5上，構建表達載體pMA5-acr。

1.5ACR在枯草芽孢桿菌中的表達

將構建好的表達載體pMA5-acr轉化至B. subtilis 168中，在卡那霉素抗性平板上篩選陽性重組子并進行酶切驗證。將驗證正確的重組菌B. subtilis 168/pMA5-acr，接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基37℃過夜培養，次日以體積分數1%的接種量轉接至50 mL LB液體培養基37℃培養24 h。發酵的菌液8 000 r/min離心10 min，用pH 7.0的PBS緩沖液洗滌細胞3次，然后離心后的細胞重懸浮于pH 7.0的PBS緩沖液中，用超聲波破碎儀破碎細胞，10 000 r/min離心30 min沉淀細胞碎片，上清液即為粗酶液，置于-4℃保存，后續用于蛋白質純化、SDS-PAGE實驗和ACR的酶活測定。

1.6酶的Ni-TNA純化

超聲破碎制得粗酶液后，經0.45 μm濾膜過濾，采用Ni-NTA蛋白純化柱來純化目的蛋白質，經過兩次上樣，蛋白質末端的6個His與Ni-NTA的金屬離子螯合。洗脫過程，首先用不含有咪唑的緩沖液洗柱，洗脫掉未與Ni-NTA結合的細胞體雜蛋白質，然后用不同濃度的咪唑（20～300 mmol/L）緩沖液進行梯度洗脫，在一定的咪唑濃度條件下，可以得到較純的酶液。

1.7重組蛋白質表達情況分析

利用SDS-PAGE分析重組菌的全細胞蛋白質［15］，用5 g/dL的濃縮膠及12～15 g/dL分離膠的不連續垂直平板電泳進行蛋白質分離，考馬斯亮蘭R-250染色；總蛋白質濃度采用Brandford方法，以牛血清蛋白質（BSA）作為標準蛋白質［16］。

1.8ACR酶活力的測定

將20 μL粗酶液加入到酶活力測定緩沖體系，立即檢測340 nm處吸光值在3 min內的變化。

乙偶姻還原酶活力測定緩沖體系：0.05 mol/L AC，5 mmol/L NAD+，磷酸鈉緩沖液pH 6.5。

總酶活力（U/mL）定義：每毫升粗酶液OD600 nm每分鐘消耗1 μmol/L NADH的酶量。

比酶活（U/g）定義：總酶活（U/mL）和粗酶液蛋白質質量濃度（g/mL）的相除值。

1.9搖瓶發酵產2，3-BD實驗

重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/pMA5-acr和出發菌株B.subtilis 168經過LB液體培養基活化后，按體積分數1%的接種量轉接至10 mL種子培養基，37℃培養12 h后按照體積分數4%的接種量轉接至50 mL發酵培養基于37℃培養，發酵過程跟蹤監測菌體濃度、葡萄糖含量、相關有機酸含量、AC產量和2，3-BD產量。

1.10發酵參數分析方法

1）AC和2，3-BD含量測定：采用毛細管氣相色譜法檢測，儀器型號GC1600（JieDao TECH），色譜柱規格為柱長30 m，內徑0.32 mm，液膜厚度0.50 μm；檢測條件為柱箱溫度160℃，進樣器和檢測器溫度250℃，進樣量0.2 μL，采用FID檢測器。

2）葡萄糖含量測定：采用SBA生物傳感器測定，發酵液經適當稀釋后，取25 μL直接進樣到生物傳感器中，根據葡萄糖標準樣品濃度、儀器讀數及發酵液稀釋倍數計算發酵液中葡萄糖的含量。

3）OD測定：取一定量的種子培養液或發酵液，以相應的培養基作對照液，在600 nm處測定OD值。

4）有機酸產物含量測量：采用高效液相色譜（HPLC）測定，流動相為含有體積分數5%甲醇的50 mmol/L的KH2PO4，體積流量為1.0 mL/min，紫外檢測器檢測波長為210 nm，溫度為30℃。

2　結果與分析

2.1acr的克隆及其表達載體的構建

提取B.subtilis 168的基因組為模板，以Forawrd/Reverse引物進行PCR擴增，得到包含18 bp His編碼序列的基因片段，總長1 041 bp，見圖2。

圖2　acr基因的PCR擴增Fig.2　PCR amplification of acr gene

將目的基因片段，連接到經BamH I和Mlu I酶切的pMA5上，構建表達載體pMA5-acr，并且轉化至B.subtilis 168感受態中。獲得的重組表達載體pMA5-acr經BamH I和Mlu I雙酶切驗證（見圖3），得到約7 200 bp和1 040 bp大小的片段，剛好對應線性化的pMA5和acr的大小，表明外源基因acr已經正確連接到表達載體pMA5上。

2.2ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中的表達

將重組載體pMA5-acr轉化至B.subtilis 168，在卡那霉素抗性平板上篩選陽性重組子，即得B. subtilis 168/pMA5-acr，將其接種于LB液體培養基培養24 h，收集菌體并破碎，菌體用pH 7.0的PBS緩沖液懸浮，采用超聲波破碎細胞，將破碎上清液及其純化蛋白質進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示，ACR的相對分子質量約為39 kDa，與預期的蛋白質相對分子質量大小相符，表明ACR在B. subtilis 168/pMA5-acr中成功獲得了表達。

圖3　重組質粒pMA5-acr的酶切驗證Fig.3　Identification of the recombinant plasmid pMA5-acr by enzyme digestion

圖4　ACR表達與純化的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ACR

2.3ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中的酶活力測定

分別測定重組菌和原始菌破碎上清液中ACR的酶活力，結果如表2所示，與原始菌株相比，重組菌中ACR的比酶活提高了3.48倍，表明ACR在B. subtilis 168里成功過量表達。

表2　B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr的ACR酶活Table 2　ACR enzyme activities of B.subtilis 168 and B. subtilis 168/pMA5-acr

2.4過量表達ACR對菌體生長、糖耗和2，3-BD積累的影響

對B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr進行發酵實驗，菌體量和葡萄糖變化曲線見圖5，AC和2，3-BD發酵曲線見圖6，發酵特征分析見表3。重組菌在前期的生長速度較慢，發酵培養16 h后，菌體生長速度加快，80 h達到最高菌體量。可能的原因是ACR的過量表達，加重了菌體的負擔，前期生長受到抑制。但是過量表達ACR后，對菌體生長有害的分支路徑副產物有機酸等減少了，所以后半段的菌體長勢較好，菌體量也比出發菌高，使得2，3-BD的合成具備良好的細胞基礎。

圖5　發酵過程中OD和糖耗曲線Fig.5　Curves of OD and Glucose during the fermentation

從圖5可以看到，重組菌的葡萄糖變化是一個前期下降平緩，中后期較為迅速的過程，而出發菌的糖耗曲線則較為均衡。這種現象表明，過量表達ACR，對菌體的生長造成負擔。在前期，菌體生長緩慢，對于碳源的消耗減少，葡萄糖質量濃度下降較為平緩；而當菌體進入2，3-BD合成期后，對碳源的需求大大加強，發酵培養16 h，葡萄糖質量濃度開始較快減少。

圖6和表3顯示，發酵培養80 h，重組菌的2，3-BD的產量達到最大值33.08 g/L，比出發菌提高了28.62%；轉化率達37.56%，提高了22.87%；副產物AC 11.59 g/L，降低了20.01%；2，3-BD/AC比率為2.854，提高了60.79%。過量表達ACR，并且控制發酵條件在弱酸性，促進了由AC到2，3-BD的轉化程度，成功地使主產物2，3-BD的產量提高，同時降低了副產物AC的積累。

圖6　發酵過程中AC和2，3-BD曲線Fig.6　Curves of AC and 2，3-BD during the fermentation

表3　發酵特征分析Table 3　Analysis of fermentation results

2.5過量表達ACR對有機酸積累的影響

對B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr兩株菌發酵液進行有機酸測定分析，結果如表4所示，相比出發菌，重組菌株發酵液中副產物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸分別降低了15.21%、34.35%、35.39%、39.53%。ACR的活力和NADH的含量是2，3-BD合成的兩個重要因素，過量表達ACR，促進了從AC到2，3-BD的合成效率。獲得了更多2，3-BD就意味著有更多的NADH參與了AC向2，3-BD的轉化，也就是說該過程需要消耗更多的NADH，而用于需要NADH參與的其他有機酸副產物的NADH的量會相應減少，這可能是相關支路的有機酸積累量減少的原因所在。

表4　ACR過量表達對發酵過程有機酸質量濃度的影響Table 4　Effects of overexpressing ACR on organic acidsin fermentation

3　結語

以安全菌株B.subtilis 168為出發菌，克隆其乙偶姻還原酶基因acr，構建重組質粒pMA5-acr，將重組質粒轉化入B.subtilis 168，構建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/pMA5-acr。測定了重組菌ACR的酶活，并在弱酸性條件下進行發酵試驗。結果表明，ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中實現了過量表達，主產物2，3-BD的產量得到提高，而副產物AC和相關有機酸的積累量則不同程度下降。2，3-BD高產菌株主要是克雷伯氏菌、產氣腸桿菌和粘質沙雷氏菌［3，9-10］，然而這些菌株都具有潛在致病性，不符合工業化安全生產的要求。而枯草芽孢桿菌有長期制備發酵食品的歷史，不產內毒素和致熱敏蛋白質，是一種公認安全的微生物，無論是作為出發菌還是宿主菌都具有很強可行性［17］。過量表達ACR和適當控制發酵pH，增強了合成2，3-BD的碳源通量，消耗了更多的輔酶NADH。相應地，AC和需要NADH參與的相關有機酸合成所需的碳源流量和NADH則會減少，因而成功地實現了主產物2，3-BD產量提高和相關副產物產量減少的目標。雖然重組菌產2，3-BD的產量和國內外最高產量還有一定的差距［1］，但是相信通過進一步的分子改造和發酵條件優化，一定能實現微生物法高效安全生產2，3-BD的目標。

［1］Ji X J，Huang H.Microbial 2，3-butanediol production：a state-of-the-art review［J］.Biotechnology Advances，2011，29（3）：351.

［2］Garg S K，Jain A.Fermentative production of 2，3-butanediol：A review［J］.Bioresource Technology，1995，51：103-109.

［3］Syu M J.Biological production of 2，3-butanediol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55（1）：10-18.

［4］Jarboe L R，Zhang X，Wang X，et al.Metabolic engineering for enzymes in Clostridium［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010：761042.

［5］付晶，王萌，劉維喜，等.生物法制備2，3-丁二醇的最新進展［J］.化學進展，2012，24（11）：2268-2276. FU Jing，WANG Meng，LIU Weixi，et al.Latest advances of microbial production of 2，3-Butanediol［J］.Progress in Chemistry，2012，24（11）：2268-2276.（in Chinese）

［6］Magee R，Kosaric N.The microbial production of 2，3-butanediol［J］.Advances in Applied Microbiology，1987，32：89-161.

［7］Long S K，Patrick R.Microbial production of 2，3-Butylene glycol from cheese whey［J］.Applied and Environment Microbiology，1982，43（5）：1216-1218.

［8］Fulmer E I，Christensen L M，Kendali A R J.Production of 2，3-Butylene glycol by fermentation［J］.Industrial and Engineering Chemistry，1933，25：798-800.

［9］Celinska E，Grajek W.Biotechnological production of 2，3-butanediol-current state and prospects［J］.Biotechnology Advances，2009，27：715-725.

［10］Garg S K，Jain A.Fermentative production of 2，3-butanediol：a review［J］.Bioresource Technology，1995：103-109.

［11］Maddox I S.Microbial production of 2，3-butanediol［J］.VCH Verlagsgesellschaft mbH，1996：269-291.

［12］Larsen S H，Stormer F C.Diacetyl（acetoin）reductase from Aerobacter aerogenes Kinetic mechanism and regulation by acetate of the reversible reduction of acetoin to 2，3-butanediol［J］.European Journal of Biochemistry，1973，34（1）：100-106.

［13］Machielsen R，Uria A R，Kengen S W M，et al.Production and characterization of a thermostable alcohol dehydrogenase that belongs to the aldo-keto reductase superfamily［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，62：233-238.

［14］Wang Z，Song Q，Yu M，et al.Characterization of stereospecific acetoin（diacetyl）reductase from Rhodococcus erythropolis WZ010 and its application for the synthesis of（2S，3S）-2，3-butanediol［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2013：1.

［15］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，5259：680.

［16］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

［17］李靜靜，徐美娟，張顯，等.一種耐低溫α-乙酰乳酸脫羧酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達［J］.食品與生物技術學報，2013，32（5）：522. LI Jingjing，XU Meijuan，ZHANG Xian，et al.High-Level expression of Cold-Adapted α-acetolactate decarboxylase in Bacillus subtilis［J］.Jouranl of Food Science and Biotechnology，2013，32（5）：522.（in Chinese）

Improved 2,3-Butanediol Production by Overexpressing Acetoin Reductase in Bacillus subtilis 168

LI Xiupeng1，YANG Taowei2，XU Meijuan3，ZHANG Xian4，RAO Zhiming*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Bacillus subtilis 168 is a safe strain for industrial-scale microbial production of 2，3-butanediol（2，3-BD）.However，a large quantity of by-product of acetoin（AC）is accumulated during 2，3-BD fermentation process.Acetoin reductase（ACR）is the key enzyme which catalyzes the conversion of acetoin to 2，3-BD.In this study，in order to improve 2，3-BD production，we firstly cloned the acr gene of acetoin reductase into B.subtilis 168，and then further constructed the recombinant strain B.subtilis 168/pMA5-acr.The results showed that the yield and conversion rate of the 2，3-BD were increased up to 28.62%and 22.87%by the recombinant strain，respectively. Whereas the accumulation of the main by-product of acetoin decreased by 20.01%.Furthermore，the molar yields of by-products of formic acid，acetic acid，lactic acid，and succinate were also decreased.

Acetoin reductase，2，3-Butanediol，Acetoin，B.subtilis 168

Q 78

A

1673—1689（2016）03—0252—06

2014-11-26

國家973計劃項目（2012CB725202）；國家自然科學基金項目（31400082，21276110）；教育部重點科研項目（113033A）；江蘇高校優勢學科建設工程資助和111引智工程項目（111-2-06）。

饒志明（1975—），男，江西臨川人，農學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業微生物育種和發酵代謝方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn