HCY-2在正常人胚消化系統發育中的作用

張元元，李耀康，王光明△（大理大學臨床醫學院：.內科；.病理科，云南大理67000）

HCY-2在正常人胚消化系統發育中的作用

張元元1，李耀康2，王光明2△（大理大學臨床醫學院：1.內科；2.病理科，云南大理671000）

目的研究同型半胱氨酸誘導基因2（HCY-2）在人胚消化系統發育的主要器官食管、胃、小腸和肝臟中的表達，探討HCY-2在消化系統發育中的作用。方法收集不同時期正常發育的人胚食管、胃、小腸和肝臟，采用免疫組織化學卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法和圖像分析技術對食管、胃、小腸和肝臟HCY-2的表達進行半定量分析。結果HCY-2在人胚食管、胃、小腸和肝臟發育的整個過程中均表達，不同妊娠期表達強弱不等，表達蛋白主要分布在消化管黏膜上皮細胞和肝細胞內，并且分布在細胞質中。HCY-2在食管黏膜上皮細胞的表達，妊娠中期最強，妊娠早期最弱；HCY-2在胃黏膜上皮細胞的表達，近足月最強，妊娠中期最弱；HCY-2在小腸黏膜上皮細胞和肝細胞的表達隨著胚胎的發育而逐漸減弱，妊娠早期最強，近足月最弱。結論HCY-2可能參與了人胚消化管和消化腺的發育。

高半胱氨酸；基因；消化系統/胚胎學；免疫組織化學；同型半胱氨酸誘導基因-2；人胚；消化管；消化腺

同型半胱氨酸誘導基因2（homocysteine induced gene-2，HCY-2）是用同型半胱氨酸刺激體外培養血管平滑肌時克隆的新基因［1-2］，在成年大鼠肝臟、肺臟、腎臟、心臟、血管、脊髓和腦組織等器官，以及在人胚心臟發育過程中廣泛表達［3-4］，在畸形人體胚胎心臟中的表達異常［4］。王光明等［5］研究發現，用同型半胱氨酸刺激培養的心肌細胞增殖與HCY-2的表達密切相關，但HCY-2在人胚消化系統中的表達及HCY-2表達異常與消化系統發育畸形的關系尚鮮見報道。為探討人胚消化系統發育中HCY-2的表達狀態，本研究采用免疫組織化學方法分析發育不同時期正常人胚食管、胃、小腸和肝臟HCY-2的表達變化，旨在揭示HCY-2表達蛋白在人胚消化系統發育中的作用。

1　材料與方法

1.1材料（1）HCY-2抗體購自北京大學醫學部心血管研究所。（2）正常人胚（胎齡以受精齡計算）20例，其中妊娠早期（4～8周）人胚6例，妊娠中期（3～4個月）人胚5例，妊娠晚期（5～6個月）人胚5例，近足月（8個月以上）人胚4例。以上人胚均來源于北京大學附屬第三醫院和北京市和平里醫院，所有胚胎均因某種原因流產后已死亡。

1.2方法

1.2.1人胚食管、胃、小腸和肝臟的獲得取正常發育不同時期的人胚食管、胃、小腸和肝臟，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后，以5 μm厚度組織切片。

1.2.2免疫組織化學卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法為顯示正常發育不同時期人胚食管、胃、小腸和肝臟HCY-2的表達，按照免疫組織化學ABC法步驟進行染色，其中抗HCY-2抗體為1∶800（體積比），陰性對照組用0.1 mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液代替一抗。

1.2.3圖像分析用Q-500圖像分析系統測定不同發育時期正常人胚食管、胃、小腸和肝臟HCY-2陽性反應部位的灰度值，同時測定無細胞區域的灰度值為本底值，然后換算為相對含量（任意單位），每張切片隨機分析3個視野，每個樣本取3張切片。

1.3統計學處理應用SPSS10.0統計軟件進行數據分析，各組相對含量以±s表示，采用One-way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1HCY-2在人胚食管的表達HCY-2在人胚食管發育的整個時期均有表達，其表達主要分布于食管黏膜上皮細胞的細胞質內（圖1、表1）。陽性反應由于強度不同而呈現不同顏色，由弱至強為淺黃色、黃色或深棕色，妊娠早期表達最弱，妊娠中期最強；妊娠早期與其他3個時期比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），妊娠中期與妊娠晚期和近足月比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1　HCY-2在人胚食管的表達（ABC法染色，200×）

表1　不同發育時期正常人胚食管黏膜上皮細胞HCY-2的表達比較

2.2HCY-2在人胚胃的表達HCY-2在人胚胎胃發育的整個時期均有表達，其表達主要分布于胃黏膜上皮細胞的細胞質內（圖2、表2）。妊娠中期表達最弱，近足月最強；妊娠晚期與妊娠中期比較，差異有統計學意義（P＜0.05），近足月與其他3個時期比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

圖2　HCY-2在人胚胃的表達（ABC法染色，200×）

表2　不同發育時期正常人胚胃黏膜上皮細胞HCY-2的表達比較

2.3HCY-2在人胚小腸的表達HCY-2在人胚小腸發育的整個時期均有表達，其表達主要分布于小腸黏膜上皮細胞和小腸腺細胞的細胞質內（圖3、表3）。HCY-2在小腸黏膜上皮細胞的表達隨胚胎的發育而逐漸減弱，妊娠早期最強，近足月最弱；妊娠早期與妊娠晚期和近足月比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），妊娠中期與妊娠晚期和近足月比較，差異也均有統計學意義（P＜0.05）。

圖3　HCY-2在人胚小腸的表達（ABC法染色，200×）

表3　不同發育時期正常人胚小腸黏膜上皮細胞HCY-2的表達比較

2.4HCY-2在人胚肝臟的表達HCY-2在人胚肝臟發育的整個時期均有表達，其陽性產物主要分布于肝細胞的細胞質內（圖4、表4）。HCY-2在肝細胞的表達隨著胚胎的發育而逐漸減弱，妊娠早期表達最強，近足月最弱；妊娠早期與其他3個時期比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），妊娠中期與妊娠晚期和近足月比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），妊娠晚期與近足月比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖4　HCY-2在人胚肝臟的表達（ABC法染色，200×）

表4　正常人胚發育不同時期肝臟細胞中HCY-2的表達比較

3　討　論

HCY-2是陳光慧等［6］用同型半胱氨酸刺激培養的大鼠血管平滑肌細胞而得到的4個新的cDNA序列之一。有研究發現，HCY-2與細胞凋亡密切相關［1，6］。HCY-2在成年SD大鼠的肝臟、肺臟、腎臟、心臟、血管、脊髓和腦組織等器官，以及在人胚心臟發育的整個過程中均持續表達［3-4］，但是除心臟外，在胚胎發育時期的其他臟器中是否表達及表達情況尚不清楚。

本研究發現，HCY-2在人胚食管、胃、小腸和肝臟發育的整個時期均表達，其表達蛋白主要分布在消化管的黏膜上皮細胞和肝細胞內，并且分布在細胞質中。李英等［3］研究發現，在成年SD大鼠中，HCY-2在功能活躍或分裂增殖能力強的細胞的器官中表達較高，而在培養的心肌細胞中給予不同劑量的同型半胱氨酸刺激的相關研究顯示，HCY-2在培養的人胚心肌細胞內的表達與培養的心肌細胞的增殖呈正相關，其在心肌細胞內高表達，并伴隨細胞的增殖率升高，從而說明高表達的HCY-2可以促進心肌細胞的生長和增殖；HCY-2在培養的心肌細胞低表達時，細胞生長率隨之降低，從而說明低表達的HCY-2對心肌細胞的生長和增殖具有抑制作用［5］。在人胚食管、胃、小腸和肝臟發育的整個時期，參與構成食管、胃、小腸和肝臟的細胞數量逐漸增多，此時，HCY-2持續表達。推測在人胚食管、胃、小腸和肝臟發育過程中，HCY-2的表達與組成食管、胃、小腸和肝臟的細胞生長、增殖有關，可通過調節細胞增殖以影響或調節人胚消化器官的發育。

有研究在雞胚中轉HCY-2時發現，HCY-2的異常表達可以導致雞胚包括心內膜墊缺損的心臟結構紊亂，同時還阻礙心室、心房的發育，以及心肌細胞在超微結構水平發生改變［7-9］；在培養的人胚心肌細胞給予同型半胱氨酸刺激誘導HCY-2表達改變后，心肌細胞在超微結構水平也發生變化［10］。HCY-2異常表達時雞胚心血管系統出現包括心臟過小、異位心和心外露等發育畸形。由此認為，HCY-2的異常表達與胚胎畸形密切相關。在內皮細胞的研究中發現，HCY-2的正常表達可以促進內皮細胞凋亡，然而，細胞凋亡對維持胚胎正常發育具有關鍵作用［11-12］。因此，推測HCY-2的表達產物通過介導細胞凋亡以調節人胚食管、胃、小腸和肝臟的發育。

陳光慧等［6］研究還發現，HCY-2為凋亡促進基因。而王光明等［4］在對室間隔膜部缺損的人胚心臟的研究中發現，HCY-2的表達出現異常，推測在胚胎心臟發育過程中，HCY-2可介導細胞凋亡而參與心臟的分隔。另有研究顯示，HCY-2蛋白編碼的基因與受體相互作用蛋白家族3（receptor interacting proteins 3，RIP3）基因高度同源［10］，為RIP3的同源基因。RIP3基因可以激活半胱天冬酶-2，然后通過一系列的級聯反應促進細胞凋亡［13］。在Hela細胞株中，當RIP3基因沉默后，由于環磷酸腺苷（cAMP）和環磷酸鳥苷（cGMP）不能被激活，從而使有cAMP和cGMP參與的細胞信號轉導受阻，細胞無法維持正常功能［14-15］。因此，在人體胚胎發育過程中，HCY-2的表達對食管、胃、小腸和肝臟正常結構的形成具有重要作用，但是還有待于進一步研究其具體作用機制：（1）在細胞水平分別研究食管、胃、小腸和肝臟HCY-2陽性細胞在HCY-2表達改變時細胞增殖、形態的改變；（2）研究在食管、胃、小腸和肝臟畸形的胚胎中HCY-2的表達變化規律；（3）在動物水平通過基因敲入和基因敲除技術使HCY-2表達異常，以研究食管、胃、小腸和肝臟的發育。這樣有可能完全闡明HCY-2在胚胎食管、胃、小腸和肝臟發育中的作用及其機制。

［1］陳光慧，張晨輝，朱燕青，等.一個新的高血壓病相關基因的克隆和表達［J］.中華醫學雜志，1997，77（11）：823-828.

［2］陳光慧，朱燕青，張晨輝，等.同型半胱氨酸/半胱氨酸誘導血管平滑肌細胞中的新cDNA［J］.中國生物化學與分子生物學報，1998，14（1）：8-14.

［3］李英，呂丹瑜，畢振伍，等.高同型半胱氨酸誘導基因HCY-2在大鼠體內的表達與分布［J］.北京大學學報：醫學版，2002，34（4）：333-336.

［4］王光明，張淑惠，李英，等.同型半胱氨酸誘導基因在正常和畸形人胚心臟中的表達［J］.解剖學報，2004，35（1）：96-99.

［5］ 王光明，李英，呂丹瑜，等.同型半胱氨酸對人胚心肌細胞HCY-2表達的影響［J］.解剖學報，2003，34（1）：53-56.

［6］陳光慧，高煒，李勇，等.一種新的細胞凋亡相關基因——高同型半胱氨酸誘導基因HCY-2的功能初探［J］.中國醫學科學院學報，2000，22（4）：383-387.

［7］李勇，陳星，齊佩文，等.同型半胱氨酸對雞神經胚形成期胚胎的發育毒性和致畸作用初探［J］.中國優生優育，1998，9（1）：7-9.

［8］李勇，李松，陳光慧，等.HCY-2基因和同型半胱氨酸與雞胚先天性心臟畸形發生的關系［J］.中華醫學雜志，2000，80（2）：131-134.

［9］李勇，李竹，陳星，等.同型半胱氨酸對雞胚早期心血管發育的影響［J］.中華預防醫學雜志，1999，33（3）：137-139.

［10］Zhao LJ，Wang GM，Lu DY，et al.Homocysteine，hRIP3 and congenital cardiovascular malformations［J］.Anat Embryol（Berl），2006，211（3）：203-212.

［11］Jezek D，Kozina V.Apoptosis during embryo development［J］.Acta Med Croatica，2009，63 Suppl 2：S37-41.

［12］Velkey JM，Bernanke DH.Apoptosis during coronary artery orifice development in the chick embryo［J］.Anat Rec，2001，262（3）：310-317.

［13］Sun X，Lee J，Navas T，et al.RIP3，a novel apoptosis-inducing kinase［J］.J Biol Chem，1999，274（24）：16871-16875.

［14］Wang Z，Jiang H，Chen S，et al.The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways［J］. Cell，2012，148（1/2）：228-243.

［15］Narayan N，Lee IH，Borenstein R，et al.The NAD-dependent deacetylase SIRT2 is required for programmed necrosis［J］.Nature，2012，492（7428）：199-204.

Role of HCY-2 in normal human embryonic digestive system development

Zhang Yuanyuan1，Li Yaokang2，Wang Guangming2△（1.DepartmentofInternalMedicine；2.DepartmentofPathology，ClinicalCollege，DaliUniversity，Dali，Yunnan671000，China）

ObjectiveTo research the expression of homocysteine induced gene（HCY-2）in the main organs of esophagus，stomach，small intestine and liver during the human embryonic digestive system development and its role in digestive system development.MethodsThe different periods of normal developmental human embryonic esophagus，stomach，small intestine and liver were collected and the HCY-2 expression in these organs was semi-quantitatively analyzed by adopting the immunohistochemical avidin-biodin-peroxidase compound method and image analysis technique.ResultsHCY-2 was expressed during the whole development process of human embryonic esophagus，stomach，small intestine and liver.Different pregnant stages had different expression intensities.The expression protein was mainly distributed in the mucosal epithelial cells of digestive tube and hepatocytes，moreover in the cytoplasm.The expression of HCY-2 in esophageal mucosal epithelial cells was strongest in middle stage of pregnancy and weakest in the early stage of pregnancy；the expression of HCY-2 in the stomach mucosal epithelial cells wasstrongestnearfullterm andweakestin the middle stage ofpregnancy；the expression ofHCY-2in smallintestine mucosalepithelial cells and liver cells was attenuated gradually following embryo developing，which was strongest in the early pregnancy and weakest near full term.ConclusionHCY-2 could participate in the development of human embryonic digestive tube and digestive glands.

Homocysteine；Genes；Digestive system/embryology；Immunohistochemistry；Homocysteine induced gene 2；Human embryo；Digestive tube；Digestive gland

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.013

A

1009-5519（2016）01-0038-03

張元元（1974-），碩士研究生，副教授，主要從事內科學教學與研究工作。

△，E-mail：420869015@qq.com。

（2015-10-25）