PICK1對人肝癌細胞HepG2增殖的影響

謝　娟，周　群，劉雪姣，黃　成，孟 曉明，李 俊

PICK1對人肝癌細胞HepG2增殖的影響

謝娟1，2，3，周群1，2，3，劉雪姣1，2，3，黃成1，2，3，孟 曉明1，2，3，李 俊1，2，3

目的 檢測蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（PICKl）在肝癌、癌旁組織中的表達，初步探討PICK1對人肝癌細胞HepG2增殖的作用及其可能機制。方法 應用qRT-PCR、Western blot、HE和免疫組織化學染色法分析比較人肝癌和癌旁組織中PICK1蛋白的表達；培養HepG2細胞，體外給予不同濃度的FSC-231（PICKl的PDZ結構域小分子抑制劑），通過MTT法檢測HepG2細胞的活力；采用流式細胞術檢測HepG2細胞周期變化；進一步采用Western blot法檢測G1/ S-特異性周期蛋白-D1（CyclinD1）、原癌基因C-myc和Notch信號通路蛋白表達。結果 肝臟病理組織學檢測提示肝癌組織病變明顯。免疫組化結果顯示，肝癌組織中相比癌旁組織中的PICKl抗原陽性細胞顯著增多（P＜0.05），且多分布在肝實質細胞質區域；qRT-PCR和Western blot結果顯示肝癌組織中PICK1 mRNA及蛋白水平與癌旁組相比顯著升高（P＜0.05）；體外實驗證明，與陰性對照組相比，FSC-231能夠抑制HepG2細胞的增殖，并且明顯抑制CyclinD1、C-myc和Notch1同源蛋白1（Notch1）、Hes-1蛋白表達（P＜0.05）。結論 提示PICK1可能參與肝癌的發生發展，PICK1的PDZ結構域抑制劑可以抑制肝癌細胞的增殖，此作用可能與Notch信號通路相關。

PICK1；FSC-231；HepG2細胞；肝癌；肝細胞增殖；CyclinD1；Notch-1；Hes-1

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.004.html

原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是死亡率居于世界第二的常見惡性腫瘤，近年來中國的肝癌發生率逐年上升［1］。肝癌的發生、發展受多種因素影響，其具體機制尚未清楚。蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（protein interactingwith Cαkinase 1，PICKl）廣泛分布于機體的組織細胞內，由卷曲螺旋區、酸性氨惡酸區、PDZ結構域和BAR結構域組成，其PDZ與BAR結構域能夠募集包括腫瘤相關蛋白在內的多種功能蛋白質并調節其趨向定位，廣泛參與多種惡性腫瘤的發生發展［2-4］。然而目前尚無相關PICK1在肝癌中的表達情況及病理機制的文獻報道。該研究擬應用PICKl的PDZ結構域小分子抑制劑FSC-231觀察 PICK1對人肝癌細胞 HepG2細胞的增殖以及G1/S-特異性周期蛋白-D1（G1/S-specific cyclin-D1，CyclinD1）、原癌基因 C-myc和Notch1同源蛋白1（Notch homolog 1，Notch1）、Hes-1蛋白表達變化的影響，初步探討PICKl在肝癌中的作用以及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1肝癌組織 肝癌組織和癌旁組織由安徽醫科大學第一附屬醫院普外科提供。

1.1.2細胞株 人肝癌細胞HepG2由安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科提供。

1.1.3主要材料與試劑 FSC-231購于德國Merck集團有限公司，分子量313.14，貨號CAT52953；PICK1抗體購于美國Abcam公司；CyclinD1、C-myc、Notch-1、Hes-1抗體購于美國Cell Signaling公司；βactin抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；一抗稀釋液購于上海碧云天生物技術有限公司；二抗均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；RIPA裂解液購于上海信則生物科技有限公司；PVDF膜購于北京索萊寶科技有限公司；顯影液購于北京信力益達商貿有限公司；噻唑藍 MTT和碘化丙錠（PI）購于美國Sigma公司；培養基購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；TRIzol Reagent RNA提取試劑購于美國Invitrogen Life Technologies公司；SYBR Green逆轉錄試劑盒均購于寶生物工程（大連）有限公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4儀器與設備 Napco-6100型細胞培養箱（美國杜邦公司）；多功能顯微鏡、倒置相差生物顯微鏡（日本OLYMPU公司）；酶標儀MK3（荷蘭雷勃公司）；Eppendorf Centrifuge 5415R冷凍離心機、Mastercycle epgradient Eppendorf PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）；Bio-RAD Power Pac Basic電泳儀；電子天平FA2004A（上海精天電子儀器廠）；流式細胞儀（美國Beckman有限公司）。

1.2方法

1.2.1HE染色和免疫組織化學染色 將肝組織經4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染色制成玻片。采用SP法染色常規脫蠟后用過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育15 min；PBS沖洗后加0.1%的胰蛋白酶消化20 min，置于非免疫性動物血清中室溫孵育10min；一抗4℃孵育過夜，用PBS清洗后加生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min；用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液孵育，30 min后用DBA顯色、蘇木精復染、封片觀察。最后將玻片置于倒置顯微鏡下觀察實驗結果。

1.2.2HepG2細胞的培養和傳代 用含10%胎牛血清的 DMEM培養液，在37℃5%CO2及飽和濕度條件下培養，細胞為貼壁生長，每2～3 d用胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3細胞增殖實驗 取對數生長期的HepG2細胞，以5 000/孔的細胞密度接種于96孔板中，每孔加入200μl細胞懸液鋪板。細胞貼壁后，用含不同濃度FSC-231（0、5、25、50、100、200μmol/L）的培養基繼續培養細胞。分別培養24、48、72 h后棄去原培養液，每孔加入180μl無血清培養基和20μl（5 mg/ml）MTT貯存液繼續培養，4 h后加入150μl DMSO，振蕩10 min，待結晶充分溶解后，置搖床低速振蕩10 min，使結晶充分溶解，在492 nm處用酶標儀檢測每孔的光密度（optical density，OD）值。按公式計算FSC-231對HepG2的生長抑制率，生長抑制率（%）=（1-OD給藥組/OD對照組）×100%。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期 將HepG2細胞以4×105接種于細胞培養瓶中，待細胞貼壁后，用含不同濃度FSC-231（0、5、25、50μmol/L）培養基繼續培養24 h后收集細胞用胰蛋白酶消化重懸，1 200 r/min低速離心5 min后用PBS洗2次，收集細胞沉淀于75%冰乙醇中固定，12 h后3 000 r/min離心5 min，去上清液，PBS洗1次，加入PI染液，室溫下染色30 min后樣品4℃避光保存，最后應用流式細胞儀進行檢測，用軟件計算細胞周期各時相DNA的百分含量。

1.2.5肝臟組織總RNA提取和RT-PCR 取肝癌及癌旁組織各30 mg于1 ml TRIzol中，充分剪碎研磨，提取總RNA。根據逆轉錄酶說明書將總RNA逆轉錄成cDNA，按照熒光定量染料SYBR Green試劑盒說明書制備反應混合體系，設置反應條件，采用β-actin作為本實驗的內參，上機檢測。本實驗所需引物序列如下：PICK1（F：5′-CCTGCCTCTATATCG TCCAGGTA-3′；R：5′-ATCGCCAGCTGCTGCCACTGT-3′），β-actin（F：5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′；R：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′）。

1.2.6Western blot檢測肝臟組織中PICK1蛋白表達變化和HepG2細胞中CyclinD1、C-myc、Notch1蛋白的表達 取肝癌及癌旁組織各50 mg于1 ml裂解液（含10μl PMSF）中，置于冰上裂解30 min后4℃，12 000 r/min離心 30 min，取上清液加入蛋白上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；取對數期生長的HepG2細胞消化后接種于培養瓶中，每孔細胞數約為2× 105個，待細胞貼壁后，用含不同濃度（0、5、25、50 μmol/L）PICK1抑制劑FSC-231的培養基繼續培養，24 h后收集細胞，提取細胞。每組加1 ml裂解液（含10μl，PMSF），同上步驟處理提取的細胞蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后用BioRAD濕轉儀器將蛋白轉到膜上，電流200 mA，用5%脫脂奶粉封閉膜4 h后用TBST清洗，與1∶500一抗4℃孵育過夜，一抗濃度為：CyclinD1（1∶500）、C-myc（1∶500）、PICK1（1∶500），洗膜，每次10 min，共洗4次，再與1∶1 000的與一抗種屬相匹配的二抗室溫孵育1 h，再用TBST清洗膜3次，每次10 min，用ECL發光試劑盒顯影，掃描成像結果用Image J軟件分析，以β-actin為內參。

1.3統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據用 ˉx±s表示；One-Way ANOVA法檢驗各組間差異。所有實驗重復3次。

2　結果

2.1人肝臟組織病理學檢測 肝癌癌旁組織中肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，未見病理性改變；肝癌組織肝小葉結構被嚴重破壞，肝細胞胞核增大且不規則并伴有大量脂肪空泡；免疫組織化學染色結果顯示，肝癌組織中PICK1蛋白主要表達在肝癌細胞質內，呈強陽性，而癌旁組織中PICK1蛋白表達量相對較低。見圖1。

2.2人肝癌組織中PICK1的m RNA和蛋白表達水平 RT-PCR及Western blot結果顯示，與肝癌癌旁組織相比，肝癌組織中的PICKlmRNA相對表達量顯著增高8倍，蛋白相對表達量顯著增高3倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1　PICK1在不同肝臟組織中的表達 SP×200A：癌旁組織；B：肝癌組織；1：HE染色；2：免疫組織化學染色

圖2　PICK 1在不同肝臟組織中的　mRNA和蛋白表達情況1：癌旁組織；2：肝癌組織；與癌旁組織比較：*P＜0.05

2.3PICK1的PDZ結構域抑制劑FSC-231對HepG2細胞增殖的影響 用含不同濃度FSC-231的培養基培養HepG2細胞。在0～200μmol/L濃度范圍內，分別在24、48、72 h測定HepG2細胞生長OD值，計算FSC-231對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制率。MTT法結果顯示與0μmol/L FSC-231組相比，FSC-231可呈濃度和時間依賴性地降低HepG2細胞生長OD值，升高細胞增殖抑制率，其中，50μmol/L FSC-231組對細胞的抑制作用較為顯著，200μmol/L FSC-231組抑制HepG2細胞增殖的作用最明顯。與0μmol/L FSC-231組相比，25～200μmol/L FSC-231組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4PICK1的PDZ結構域抑制劑FSC-231對HepG2細胞周期的影響 用含不同濃度FSC-231的培養基刺激HepG2細胞24 h后，流式細胞術結果表明，與0μmol/L FSC-231組相比，在5～50μmol/ L濃度范圍內，50μmol/L FSC-231組的G0/G1期細胞數比例明顯升高，G2期細胞數比例明顯降低，S期細胞比例受影響較小，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示FSC-231可以影響HepG2細胞在細胞周期G0、G2期的分布。見圖3。

2.5PICK1的PDZ結構域抑制劑FSC-231對HepG2細胞中CyclinD1、C-m yc和Notchl、Hes-1蛋白表達的影響 應用PICK1抑制劑FSC-231（5、25、50μmol/L）刺激HepG2細胞后，與0μmol/L FSC-231組相比，50μmol/L FSC-231組的CyclinD1、C-myc以及Notch通路蛋白Notch1、Hes-1的蛋白表達水平呈FSC-231濃度依賴性降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

表1　FSC-231對人肝癌細胞　HepG2增殖的抑制率

3　討論

肝癌的發生發展是由多種因素所致的復雜過程，至今其發病機理尚未清楚，研究［5-7］報道PICKl能夠廣泛參與乳腺癌、肺癌、腎癌的發生發展，其發揮的促癌作用與PKCα、EphB2、ErbB2/Her-2和TIS21等腫瘤相關蛋白密切相關。PDZ結構域在基因組廣泛存在，是多種癌癥相關蛋白共同富含的功能 結構域，如AF6、TIS21、PKCα［8-9］。目前已有研究［7］證明PICK1可以通過PDZ結構域與TIS21的C端結合調節NIH 3T3細胞周期變化，與轉化生長因子-β1受體（transforming growth factor-β1 receptor，TGF-β1）的C末端結合參與乳腺癌的發生發展［10］。TIS21、Eph、TGF-β1受體均可通過各種途徑參與肝癌的發生發展［9，11-12］，然而至今尚無明確的關于PICK在肝癌中作用的研究。本實驗采用HE染色驗證肝癌組織模型成功，采用qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學染色法定性并定量分析了肝癌患者癌旁組織、肝癌組織中PICKl的表達情況。本實驗結果顯示，與肝癌癌旁組織相比，肝癌組織中PICK1 mRNA和蛋白水平均呈異常高表達，PICK1陽性表達細胞數量及程度顯著升高，且主要分布于肝實質細胞的胞漿區域，提示PICK1可能參與肝癌細胞的增殖而影響肝癌的發生、發展。FSC-231是PICKl的PDZ結構域小分子抑制劑，能夠通過影響PICK1與其他功能蛋白的結合而發揮不同藥理作用［13］。已被反復應用于PICK1疾病機理的研究。體外實驗結果進一步證明，PICK1 PDZ結構域小分子抑制劑FSC-231能夠抑制人肝癌細胞HepG2細胞的增殖，阻滯HepG2細胞周期由 G1向S期的轉變并且明顯抑制細胞周期因子CyclinD1、C-myc的蛋白表達水平。

圖3　FSC-231對HepG2細胞周期的影響A：0μmol/L FSC-231；B：5μmol/L FSC-231；C：25μmol/L FSC-231；D：50μmol/L FSC-231

圖4　FSC-231對　CyclinD1、C-myc和Notch通路蛋白表達的影響

Notch基因是一類高度保守的細胞表面受體，在人體Notch信號通路由Notch1-4受體和Jagged1、Hes-1等多種Notch配體組成，它們影響細胞的分化、凋亡、增殖等過程。有文獻［14-15］表明，C端富含PDZ結構域的Notch信號通路蛋白Jagged1、DLL1等能夠通過PDZ結構域與Ras-MAPK、Wingless/Wnt等信號通路相互調控促進肝癌發生發展，提示Notch通路蛋白可能通過PDZ結構域參與PICK1對肝癌細胞增殖的調控。本研究顯示 PDZ結構域小分子抑制劑FSC-231能夠抑制人肝癌細胞HepG2細胞中Notch1、Hes1的蛋白表達水平，其中，50μmol/L濃度組的抑制作用尤為顯著。

綜上所述，PICKl存在于肝癌病程，其可能參與肝癌細胞增殖的調控，與肝癌發生、發展密切相關，PICK1對肝癌細胞增殖的調控可能與Notch信號通路相關，然而，PICKl在肝癌病程中的具體分子機制尚待進一步研究。

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Function of PICK 1 on proliferation of human HepG2 cells

Xie Juan1，2，3，Zhou Qun1，2，3，Liu Xuejiao1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，2Institute of Liver Diseases of AnhuiMedical University，3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To investigate the probably value of PICK1 in HCC patients after hepatectomy and to determine the effects of PICK1 on the proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2.Methods The differential expression of PICK1 in paired tumor and non-tumorous tissue was evaluated by RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry.Exposure HepG2 cellswith different concentrations of FSC-231（a smallmolecule inhibitor of the PICK1 PDZDomain）.MTT assay was used to evaluate the inhibitory rate of proliferation of HepG2.After 24 h treatment of FSC-231 in HepG2 cells，themodulation of FSC-231 on cell cycle distribution of HepG2 cells was detected by flow cytometer，the CyclinD1，C-myc，Notch1，Hes-1 expression of HepG2 cells were examined by RT-PCR and Western blot.Results Compared with paired non-tumorous tissues，PICK1 were highly expressed in HCC tissue，significantly increased mRNA and protein level of PICK1 was observed in HCC tissue（P＜0.05）；FSC-231 was able to effectively inhibit cell proliferation in a concentration and time dependent pattern and significantly decreased the protein levels of CyclinD1，C-myc and Notch1，Hes-1（P＜0.05）.Conclusion PICK1 may be a potential therapeutic target gene for human hepatocellular carcinoma，probably correlating with Notch signal pathway.

PICK1；FSC-231；HepG2 cell；HCC；cell proliferation；CyclinD1；Notch1；Hes-1

R 322.47；R 329.25；R 575；R 965

A

1000-1492（2016）05-0615-05

2016-02-22接收

國家自然科學基金（編號：81473268、81273526）；安徽省科技攻關計劃（編號：1301042212）；安徽省自然科學基金項目（編號：1308085MH145）

1安徽醫科大學藥學院、2安徽醫科大學肝病研究所，3安徽省創新藥物產業共性研究院，合肥 230032

謝 娟，女，碩士研究生；

李 俊，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lijun@ahmu.edu.cn