大海馬ACE抑制肽制備及其抗氧化能力的測定

顧　偉,徐永健

(寧波大學海洋學院/應用海洋生物技術重點教育部實驗室,浙江寧波 315211)

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大海馬ACE抑制肽制備及其抗氧化能力的測定

顧偉,徐永健*

(寧波大學海洋學院/應用海洋生物技術重點教育部實驗室,浙江寧波 315211)

為了從大海馬蛋白中制備出ACE抑制肽及分析肽的抗氧化能力,本文通過比較小分子肽與ACE間的關系對蛋白酶進行了選擇,篩選出木瓜蛋白酶作為海馬蛋白的水解酶。然后,在單因素實驗基礎上采用響應面法對木瓜蛋白酶制備ACE抑制肽的關鍵參數進行了優化,結果為酶底比(E/S)為 5%、時間7.5 h、pH7.7、溫度59 ℃,測得其水解度為20.41%±0.12%,ACEIPs的IC50值為1.897±0.072 mg/mL。經Sephadex G-15分離純化后,得到五個組分,其中第三個組分(PH-I3)、第4個組分(PH-I4)和第5個組分(PH-I5)的活性最好,IC50分別為0.896、0.982、0.814 mg/mL;并對這五個組分進行了抗氧化實驗,各組分均能顯著的清除DPPH自由基、羥基自由基,具備與Fe2+的螯合能力。所以,由PH-I制備的ACE抑制肽同時具有降血壓和抗氧化的功能,在功能性食品開發中具有重要的意義。

大海馬高分子蛋白,ACE抑制肽,抗氧化能力,木瓜蛋白酶

治療和預防高血壓是當今研究的一個熱門的課題[1]。在高血壓的調節機制中,血管緊張素轉化酶(ACE)對血壓的調節起著重要的作用,所以通過抑制ACE的活性是治療高血壓的一種重要方法[2]。目前,化學合成的ACE抑制劑具有強效的同時也產生了許多副作用,因此尋找一種高效無副作用的ACE抑制劑具有重要的意義[2]。從蛋白質酶解產物中分離出的ACE抑制肽(ACEIPs)具有效果溫和、專一、高效和無副作用等特點,體現出良好的開發價值,如從大豆蛋白[3]、白蓮蛋白[4]、燕麥蛋白[5]等酶解液中分離出ACE抑制肽,并開發出多種相應的產品。

自由基與人體的許多疾病都密切相關,現在已經發現糖尿病、衰老和氧化應激損傷等疾病都與自由基的氧化反應有關。氧化應激能夠使血管受到某種程度上的損傷,從而引起高血壓等心血管疾病。正是由于自由基與許多疾病都密切相關,所以抗氧化藥物越來越多在高血壓等疾病上得到了應用。許多學者發現ACE抑制肽同時具有抗氧化的功能,如朱麗娟[6]發現玉米蛋白水解物具有抗氧化能力的同時還具有抑制ACE活性的能力;Miguel等[7]通過給自發性高血壓大鼠飼喂高含量的抗氧化劑,發現能夠有效的降低大鼠血壓,這證實了自由基對大鼠的血管有一定的損傷,抗氧化劑能夠降低血液中氧自由基的濃度,改善血管的結構和功能,從而起到降低大鼠血壓的能力。

大海馬含有較高的蛋白成分,自古為食藥同源生物[8]。對大海馬蛋白成分的分析與有效成分提取,將有效提高海馬蛋白的利用價值。本研究重點對大海馬蛋白進行酶解分析,并從酶解液中分離純化與抗高血壓有關的多肽類物質,并對其進行抗氧化方面的測定,對海馬蛋白的高效利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海馬粉大海馬由寧波大學水產養殖基地提供,凍干后,用粉碎機進行粉碎,通過AS200型震篩機過60目篩得到海馬粉。海馬蛋白(SP)由海馬粉經CO2超臨界流體萃取技術脫脂后獲得。N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、血管緊張素轉換酶(EC:3.4.15.1)、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)Sigma公司;堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復合蛋白酶和酸性蛋白酶北京索萊寶科技有限公司;Sephadex G-15Pharmacia公司;無水乙醇、抗壞血酸、硫酸亞鐵、體積分數30% H2O2等國藥集團化學試劑有限公司。

真空冷凍干燥機美國Labconco公司;DKS-24型電熱恒溫水浴鍋嘉興市中新醫療儀器有限公司;UB-7型pH計丹佛儀器(北京)有限公司;BS110S型分析天平賽多利斯(北京)教學儀器公司;超濾設備上海朗極有限公司;蛋白層析儀上海滬西青浦儀器有限公司;Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀 南昌新長征醫療科技發展有限公司;Spe-ed型超臨界萃取儀美國ASI公司制造。

1.2實驗方法

1.2.1肽的制備

1.2.1.1海馬蛋白組分(PH-I)的制備參考Jiang等[9]方法并略加改動,先后用胰蛋白酶和堿性蛋白酶分別酶解脫脂海馬粉,酶解液過濾得上清液即為海馬蛋白酶解混合溶液;用超濾膜(MWCO為20 ku)進行超濾,收集分子量大于20 ku的濾液,濃縮和冷凍干燥后得海馬蛋白粉,即為PH-I。

1.2.1.2酶解PH-I制備ACE抑制肽選用木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶,酸性蛋白酶,復合蛋白酶和風味蛋白酶等5種蛋白酶對PH-I進行再次酶解。取PH-I 0.5 g,加入25 mL蒸餾水,調節水浴鍋至每種酶所需要的最佳溫度,用0.02 mol/L HCl和0.02 mol/L NaOH溶液進行酸堿調節,底物預熱10 min,E/S為4%,酶解6 h后,沸水滅酶活10 min,終止反應。冷卻后,以3000 r/min,離心10 min,取上清液備用并冷凍干燥得到多肽粉。取多肽粉分別配成濃度為2、1.6、1.2、0.8和0.4 mg/mL五個梯度溶液,分別用于測量ACE抑制率,求出ACE的半抑制濃度IC50。

1.2.2分析測定

1.2.2.1PH-I和SP氨基酸組成分析送檢,送檢單位:上海微譜化工技術服務有限公司。樣品經酸水解和異硫氰酸苯酯(PITC)衍生化后,將衍生化的氨基酸衍生物通過島津高效液相色譜儀LC-20A分離檢測。

1.2.2.2PH-I中粗蛋白成分的測定參照半微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)。

1.2.2.3水解度(DH%)測定氨基態氮測量方法參照醬油衛生標準的分析方法(GB/T 5009.39-2003),并稍加改進來測定,取酶解液上清液10 mL,加入60 mL蒸餾水,先將pH調制8.20,再利用標準0.0077 mol/L的NaOH溶液進行滴定至pH為9.20,記錄所消耗的標準NaOH量。水解度計算公式如下:DH(%)=(h-h0)÷htot×100%=[(V2-V1)×0.0077×0.014×3]÷htot×100%,式中,DH-水解度%;h,h0-分別為實驗組和對照組中氨基態氮含量,μg/mL;htot-脫脂海馬骨粉原料總氮μg/mL;V2,V1-分別為實驗組和對照組所消耗的標準氫氧化鈉的體積,mL。

1.2.2.4ACE抑制活性測定參考李瑩測定ACE抑制率方法[10]并略作修改,具體方法為:將20 μL多肽溶液和20 μL的ACE溶液(0.1 U/mL水)加入96微孔板的微孔中,但不混合,然后加入130 μL經過預熱的底物(1.0 mmol/L FAPGG溶解于50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,包含0.3 mol/L NaCl)使其開始反應。酶標儀溫度為37 ℃,在340 nm下每1 min記錄一次吸光值,共記錄20 min?？瞻讓φ帐褂?0 μL的緩沖液(50 mmol/L的Tris-HCl,pH7.5,包含0.3 mol/L NaCl)代替多肽溶液。以吸光值(ΔA340min-1)對時間作出曲線,計算出斜率,取6～15 min的斜率來計算。

ACE抑制率(%)=(1-ΔA抑制率/ΔA空白)×100,半抑制濃度IC50:抑制50% ACE活性時所需樣品的濃度。

1.2.3木瓜蛋白酶酶解工藝條優化

1.2.3.1酶解工藝單因素實驗以DH%為指標,對影響酶解效果的E/S、溫度、pH、時間進行單因素實驗。對E/S進行單因素實驗:pH7.5,溫度55 ℃,酶解時間6 h,E/S分別為2%、3%、4%、5%和6%五個梯度;對時間進行單因素實驗,pH7.5,溫度55 ℃,E/S 5%,酶解時間分別為1、3、5、7和9 h共5個梯度;對pH進行單因素實驗,溫度55 ℃,E/S 5%,時間7 h,pH梯度分別為5.5、6.5、7.5、8.5和9.5共5個梯度;對溫度進行單因素實驗,E/S 5%,時間7 h,pH7.5,溫度梯度設置為45、50、55、60和65 ℃共5個梯度。

1.2.3.2響應面優化酶解工藝E/S為4%和5%之間,DH%存在著顯著性差異(p<0.05),而5%和6%之間DH%不存在差異(p>0.05),從節約成本的角度考慮,將設定E/S為5%。對時間、pH和溫度三因素通過響應面Box-Behnken來進行工藝優化,確定最優酶解工藝,實驗因素水平見表1。

表1　木瓜蛋白酶酶解優化的響應面實驗設計Table 1　The experimental design for Response surface experimental of Papain

1.2.5PH-I分離純化產物的抗氧化活性分析在最佳的木瓜蛋白酶酶解PH-I制備ACE抑制肽的條件下,將得到的ACE抑制肽經濃縮和真空冷凍干燥后,用Sephadex G-15分離純化,得到五個區間組分,采用清除DPPH自由基能力、Fe2+螯合能力和清除羥基自由基(·OH)能力3個指標來評價ACE抑制肽的抗氧化能力,并以BHT,EDTA和維生素C作陽性對照。DPPH自由基清除率的測定方法參照[12];亞鐵離子(Fe2+)螯合能力測定方法參照劉建華[13]和Dinis[14];清除羥基自由基(·OH)能力測定方法參照劉建華和涂勇剛[15]。

1.2.6數據處理實驗采用Microsoft Excel軟件和SAS軟件進行數據分析以及圖表編輯,Design-Expert 7.0.0軟件進行響應面數據分析。若p>0.05,則差異不顯著;若p<0.05,則差異顯著;若p<0.01,則差異極其顯著。

2　結果與分析

2.1PH-I與SP氨基酸組成成分分析

SP和PH-I氨基酸組成如表2?？傮w上看,PH-I中疏水性氨基酸(74.96%)、支鏈氨基酸(13.21%)和芳香族氨基酸(4.49%)的含量都略高于SP。一般來說,蛋白質中芳香族氨基酸含量、支鏈氨基酸含量和疏水性氨基酸含量較高者,蛋白酶解物所表現的ACE抑制率越高[16]。此外,蛋白酶解物的ACE抑制能力與氨基酸的疏水性也呈現出正相關[16]。經觀察,SP與PH-I間,疏水值大于10以上的氨基酸(Pro,Ile,Leu,Phe)在PH-I中含量要高于SP,且PH-I相比較于SP,分子量更小,更容易水解成小分子多肽。由此可知,PH-I更適于用來制備ACE抑制肽。劉佳[17]通過比較大豆蛋白與高分子量組分的大豆蛋白(HMF)疏水性氨基酸組成之間的差異,也發現類似結果。

表2　PH-I和SP中的氨基酸組成(%)Table 2　Amino acid compositions of PH-I and SP(%)

式中,疏水性氨基酸:纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly),酪氨酸(Tyr);支鏈氨基酸:纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu);芳香族氨基酸:酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)。

2.2制備ACEIPs最優酶選擇結果

在體腸實驗中，TPGS-CS/PTX膠束溶液和PTX聚氧乙烯氫化蓖麻油EL-40乙醇（1∶1）溶液相比，前者的載藥量大，主藥吸收更多。在結腸中Ka較大，而在十二指腸較小，與文獻報道[17]不同。實驗結果初步表明，TPGS-CS/PTX膠束能提高難溶性藥物PTX的生物利用度。進一步的吸收機制研究如黏蛋白吸附、采用香豆素作為熒光探針標記的材料在Caco-2細胞中的攝取等實驗也已完成，表明TPGS- CS能使攝取增加。其他機制研究正在進行中。

據報道,ACEIPs的抑制活性主要取決于C端的氨基酸組成,當C端為芳香族氨基酸時(如:Trp、Tyr、Phe、Pro),應選擇酸性蛋白酶酶解,產物多肽對ACE酶的抑制活性較強;而當C端殘基上有帶正電荷的氨基酸存在時(如Lys和Arg),應選擇木瓜蛋白酶酶解,產物的抑制活性將顯著增強[2]。N端對于抑制ACE活性也有作用,當N端為疏水性氨基酸和支鏈氨基酸時(包括Val、Ala、Tyr),選擇菠蘿蛋白酶產物的抑制活性較強[2,18]。然而,對于多肽與ACE酶之間的構效關系還僅僅局限于對已知降血壓肽氨基酸序列的定性分析,還有許多降血壓肽并不符合上述規律,所以選擇復合蛋白酶和風味蛋白酶對于發現新型的ACEIPs具有重要的意義[19]。通過對所選擇的5種蛋白酶的酶解液ACEIPs的IC50值的方差分析發現,除了菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶的IC50值之間沒有差異外,其它幾種酶的IC50值之間都存在顯著差異(p<0.05)。其中,木瓜蛋白酶的IC50值最小為2.028±0.110 mg/mL,所以,選擇木瓜蛋白酶作為酶解PH-I制備ACE抑制肽的酶(表3)。

表3　五種酶解液ACEIPs的IC50值Table 3　Values of IC50 of ACEIPs

注:若a,b,c,d字母不相同,表示相互間存在差異顯著(p<0.05);若字母相同,表示相互間差異不顯著(p>0.05)。

2.3木瓜蛋白酶單因素實驗結果

對木瓜蛋白酶酶解PH-I制備ACE抑制肽進行單因素實驗,其結果如圖1。E/S為5%和6%之間時,差異不顯著,是由于E/S為5%已經能夠完全的將PH-I水解,所以E/S為6%時的水解度與5%不存在差異(p>0.05),從節約的角度考慮將E/S設置為5%;當酶解時間為7 h,已經完全將PH-I水解,所以與9 h相比,水解度差異不顯著(p>0.05)并趨于平緩;當pH為6.5,8.5和9.5時都不是木瓜蛋白酶合適的酸堿度,抑制了酶的活力,所以與pH為7.5相比,水解度差異顯著(p<0.05);類似的,溫度為60 ℃時,是酶的合適溫度,酶解效果最好,與其他梯度間均有顯著差異(p<0.05)。因此,木瓜蛋白酶單因素實驗的結果為E/S 5%、酶解時間7 h、pH7.5、溫度60 ℃。

圖1　各因素對木瓜蛋白酶酶解PH-I水解度的影響Fig.1　The impact of various factors on the Papain hydrolysis degree of hydrolysis of the PH-I

2.4響應面優化實驗結果

2.4.1PH-I酶解條件分析和優化對酶解時間、pH和酶解溫度三因素通過響應面Box-Behnken來進行工藝優化,確定最優酶解工藝,實驗結果如表4和表5。

表4　響應面實驗表及結果Table 4　The design and results of Response surface experiments

2.4.2方差分析獲得木瓜蛋白酶的回歸方程:

表5　響應面方差分析Table 5　Analysis the Response surface of variance

注:(a)P-value Prob>F值的大小表示模型及各因素的顯著水平;(b)P-value Prob>F值大于0.05表示模型及各因素無顯著影響,P-value Prob>F小于0.05表示模型及各因素有顯著影響,P-value Prob>F小于0.01表示模型及因素有極顯著影響。

DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C+0.055AB-0.02AC-0.0345 BC-0.965A2-0.518B2-0.1033C2,其中,A、B、C分別表示時間、pH和溫度。

由表5方差分析得出,該模型Prob>F(a)值小于0.01,表明本模型是極顯著的。失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率,表5中木瓜蛋白酶的模型失擬項的Prob>F(a)值為0.0585大于0.05,模型失擬項不顯著,模型選擇合適,可以用此模型對PH-I蛋白進行酶解工藝優化。

從回歸方程及表5看,AB、AC對木瓜蛋白酶影響不顯著,A、C、A2、B2、C2對木瓜蛋白酶有極顯著影響,B、BC對木瓜蛋白酶有顯著影響?；貧w方程優化后得:

DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C-0.0345 BC-0.965A2-0.518B2-0.1033C2,式中,A、B、C分別表示時間、pH和溫度。

2.4.3交互作用分析與優化通過Design-Expert軟件求解方程,對于木瓜蛋白酶,時間和溫度對酶解效果影響均較大,其次為pH。由實驗可知,木瓜蛋白酶酶解PH-I的最佳酶解工藝為時間7.5 h、pH7.72、溫度59 ℃,預測水解度為20.49%。

圖2　酶解溫度和pH因素之間相互作用 對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.2　The interactions among temperature and pH value in response surface experiment of Papain

2.4.4驗證實驗PH-I水解度驗證:根據響應面優化的最佳工藝條件(E/S 5%,時間7.5 h,pH7.7,溫度59 ℃),實測得水解度DH=20.41%±0.12%。略小于預測值20.49%,其誤差范圍在1%之內。說明PH-I木瓜蛋白酶酶解工藝優化效果較好。

ACEIPs的IC50值的驗證:測得ACEIPs的IC50值為1.897±0.072 mg/mL,與優化前的ACEIPs的IC50值為2.028±0.110 mg/mL相比,有著顯著的提高(p<0.05)。

2.5PH-I分離純化后ACE抑制活性分析

選用Sephadex G-15對上述酶解液進行分離,所得5個部分(圖3),根據分子篩的原理,這5個區間的分子量大小依次為PH-I1>PH-I2>PH-I3>PH-I4>PH-I5。

圖3　PH-I Sephadex G-15蒸餾水洗脫曲線Fig.3　The elution curve of PH-I by water on Sephadex G-15 column chromatography

分別對純化后的五個部分進行ACE抑制活性分析(圖4),經測定PH-I3、PH-I4和PH-I5抑制肽的活性最好,3個區間的IC50值分別為0.896,0.982和0.814 mg/mL。

表6　PH-I分離純化后各組分的抗氧化能力Table 6　The antioxidant capacity of each segment was isolated by PH-I

圖4　各組分的ACE抑制活性分析Fig.4　Elution profile with ACE inhibitory activity of PH-I on Sephadex G-15

2.6PH-I分離純化后抗氧化能力分析

分離純化后的5個組分對DPPH自由基的清除能力如表6,PH-I1、PH-I3和PH-I4對DPPH自由基的清除能力較強,分別平均達到64.58%、55.79%和52.28%,與濃度為0.5 mg/mL的人工合成的BHT對DPPH自由基的清除能力較為接近。該能力較其他一些藥食同源的品種要強一些,如泰和烏骨雞活性肽的抗氧化能力,在濃度為1 mg/mL時,對DPPH自由基的清除能力最強為36.7%[15]。

分析Fe2+金屬螯合能力,PH-I5和PH-I2與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力分別為89.6%和 81.43%,略低于同濃度下EDTA(94.53%)的螯合能力。但比其他生物活性蛋白要高得多,玉米蛋白水解液8 mg/mL對Cu2+的金屬螯合能力僅為20%[20],泰和烏骨雞活性肽對金屬離子螯合能力在濃度為1 mg/mL時,與Fe2+的螯合能力為15.4%[15]。

分離純化后的5個區間多肽對羥基自由基(·OH)的清除能力,除了PH-I2的清除率較高(36.43%)外,其它四個組分對羥基自由基的清除率為11%左右。低于一些報道[21]。這可能是由于提取原料不同及測定方法的差異等造成的。

3　結論

通過分析小分子肽與ACE酶之間的關系并結合酶解后小分子肽抑制ACE能力,篩選出木瓜蛋白酶酶解PH-I;應用響應面法優化了木瓜蛋白酶的酶解工藝,優化后ACEIPs的IC50值為1.897±0.072 mg/mL,與優化前相比較,肽的活力有著顯著的提高,這說明了隨著水解度的提高,釋放出更多的短肽,使得單位質量內的短肽摩爾數增加,從而提高了肽抑制ACE的能力。酶解液經Sephadex G-15分離純化后,得到五個組分,其中PH-I3、PH-I4和PH-I5的活性最好,IC50分別為0.896,0.982和0.814 mg/mL,具有進一步分離純化出更高活性肽的意義。

由于自由基的氧化應激反應會對血管照成一定的損傷,促進高血壓的患病幾率,所以分析多肽的抗氧化能力具有一定的意義。通過分析可知,五個組分的多肽均表現出一定的抗氧化能力,但是每個組分區間對DPPH自由基、羥基自由基、Fe2+的清除率和螯合能力存在著一定的差異。PH-I1對DPPH自由基清除率為64.58%,接近0.5 mg/mL的BHT對DPPH自由基的清除率,明顯的強于其它4個組分對DPPH自由基的清除率;PH-I5與Fe2+的螯合能力最強,而PH-I5的分子量最小,小分子肽更加容易暴露活性位點,與Fe2+發生螯合作用;而PH-I2則對羥基自由基的清除率最強;多肽在DPPH自由基、羥基自由基和Fe2+上所表現出的差異,是由于這三個指標與自由基的作用機理之間的差異。所以綜合分析小分子肽對ACE的抑制能力和抗氧化能力,PH-I3、PH-I4和PH-I5適合進一步的分離純化并進行深入的研究,這對于功能性食品肽在高血壓方面的應用具有一定的指導意義。

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Preparation ofHippocampusACE inhibitory peptide and determination of antioxidant capacity

GU Wei,XU Yong-jian*

(School of Marine Sciences,Ningbo University/Key Laboratory for Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education,Ningbo 315211,China)

In order to preparation ACE inhibitory peptide fromHippocampusand determination antioxidant capacity,this article compare the relationship between the peptide and ACE,the Papain were selected out from 5 proteases to hydrolyse seahorse protein. On the basis of single-factor experiments,the key parameters of Papain were optimized by Response Surface Method for preparation ACE inhibitory peptides,the operating conditions were:enzyme to substrate(E/S)ratio of 5%,hydrolysis time of 7.5 h,pH of 7.7,hydrolysis temperature of 59 ℃;under this condition,the degree of hydrolysis(DH%)was 20.41%±0.12%,ACE inhibitory activity of IC50was 1.897±0.072 mg/mL. The hydrolyzate was divided into five fractions through Sephadex G-15,where component 3(PH-I3),component 4(PH-I4)and component 5(PH-I5)had good activity and the IC50of each fraction was 0.896 mg/mL,0.982 mg/mL and 0.814 mg/mL;the anti-oxidation experiments of five fractions,the components can scavenging DPPH.,hydroxyl radicals and chelating with the Fe2+significantly. Therefore,the PH-I prepared ACE inhibitory peptides both hypotensive and antioxidant functions,which had great significance in the development of functional foods.

Hippocampus;ACE inhibitory peptides;antioxidant capacity;Papain

2015-08-04

顧偉(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:1239156290@qq.com。

徐永健(1975-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物資源開發與利用,E-mail:xuyongjian@nbu.edu.cn。

中國國家自然科學基金資助(41276123)；國家星火項目計劃的支持(2012GA701048)。

TS218

B

1002-0306(2016)05-0201-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.031