巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑的制備及凍干保護劑響應面優化

王大欣,張　丹,*,初少華,支月娥,2,周　培,2,3,*

(1.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240;2.農業部都市農業(南方)重點實驗室,上海 200240;3.上海交通大學陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240)

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巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑的制備及凍干保護劑響應面優化

王大欣1,張丹1,*,初少華1,支月娥1,2,周培1,2,3,*

(1.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240;2.農業部都市農業(南方)重點實驗室,上海 200240;3.上海交通大學陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240)

采用真空冷凍干燥法制備巨大芽孢桿菌NCT-2菌劑,采用單因素實驗并用響應面方法對凍干保護劑配方進行了優化。以巨大芽孢桿菌NCT-2凍干存活率為考察因素,從離心濃縮條件、保護基質、保護劑篩選與復配、復水種類等方面探究影響。結果表明,離心條件為5000 r/min,10 min,選取新鮮培養基為保護基質時對巨大芽胞桿菌NCT-2凍干保護效果最佳。不同復水水質對菌體存活率無較大影響。當凍干保護劑濃度為:蔗糖4.51 mg/g、海藻糖0.90 mg/g、葡萄糖9.60 mg/g時凍干存活率最高,經驗證存活率最高可達91.8%。

巨大芽孢桿菌,真空冷凍干燥,保護劑,響應面優化

設施栽培中由于氮肥的大量施用,導致土壤次生鹽漬化,使土壤鹽分尤其是硝態氮含量增高,硝態氮在土壤和水體中積累給人類的生存帶來巨大的危害。采用微生物法修復次生鹽漬化土壤是極為有效的途徑[1]。實驗室自主從設施栽培次生鹽漬化土壤中篩選出一株耐硝酸鹽的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)NCT-2,該菌株可以有效降低土壤中硝態氮含量及土壤電導率值,并提高土壤有機質含量及微生物數量[2]。該菌株已經作為生物肥料用于生產當中,但是仍存在活菌數不高,體積大攜帶不方便,未優化配方等問題,制約了生產進一步發展。

真空冷凍干燥技術是將物料在低溫凍結后,真空條件下將冰升華為水蒸氣從而脫去物料中的水分使物料干燥的技術[3],具有可以避免物料熱敏變質、理想的速溶與復水性、體積小方便儲存等優點。但是,真空冷凍干燥過程對菌體存活率具有一定的影響。研究表明,凍干保護劑的應用是影響凍干存活率最為重要的因素[4]。因此,優化保護劑配方是提高凍干菌體存活率的關鍵途徑,響應面作為一種高效統計方法,可以用較少的實驗次數去優化多種變量,從而預測最佳的實驗結果[5]。國內已有相關利用真空冷凍干燥技術制備菌粉的研究[6-7],保護劑經響應面優化后保證了較高的菌體存活率,可見對保護劑研究具有重要意義。

本研究以前期獲得的具有良好次生鹽漬化土壤修復特性的巨大芽孢桿菌(B.megaterium)NCT-2為研究對象,應用真空冷凍干燥技術制備凍干菌劑,通過探究保護劑配方并對其進行了響應面優化,獲得了高活性巨大芽孢桿菌凍干菌劑,解決目前微生物菌劑普遍存在的活菌數不高,體積大不方便運輸,無優化配方,生產效率低等問題,為我國土壤修復菌劑的生產提供了依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

巨大芽孢桿菌(B.megaterium)NCT-2,由實驗室保藏。

種子培養基(LB):NaCl 10 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.5,121 ℃滅菌20 min。發酵培養基:酵母粉 3.0 g,蔗糖15 g,KH2PO40.5 g,MnSO40.05 g,水1000 mL。新鮮培養基:KCl 1.0 g,FeSO4·7H2O 10.0 mg,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl21.0 mg,KH2PO40.5 g,葡萄糖 15.0 g,KNO31.5 g,蛋白胨1.5 g,水1000 mL,pH7.0～7.2。脫脂奶粉懸浮基質:脫脂奶粉 100 g/L,水1000 mL。計數培養基:在LB培養基中加入15～20 g/L瓊脂即可。

ZWYR-2112B 型雙層恒溫搖床上海智城分析儀器制造有限公司;DELTA320 pH計梅特勒-托利多儀器上海有限公司;BLBIO-XGCA型5 L發酵罐上海百倫生物科技有限公司;M200PRO多功能酶標儀德國/瑞士TECAN;CT/4RO型離心機天美(中國)科學儀器有限公司;icount10型全自動菌落計數儀杭州迅速科技有限公司;FD-1-50e型真空冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑制備流程菌種活化→制備菌液→生長曲線測定→離心收集菌體→制備菌懸液→添加保護劑→真空冷凍干燥→復水

1.2.2巨大芽孢桿菌NCT-2 的培養及生長曲線的測定將巨大芽孢桿菌NCT-2接種至100 mL LB培養基中,35 ℃,180 r/min震蕩培養12 h后接入裝有3 L發酵培養基的5 L發酵罐中,初始pH7.0,轉速300 r/min、通氣量2 vvm、培養18 h后獲得發酵液。期間,每隔4 h用多功能酶標儀測定OD(660 nm)值。菌種計數采用平板稀釋涂布法進行計數。

1.2.3巨大芽孢桿菌NCT-2濃縮離心條件的確定取菌液25 mL裝于滅菌的離心管中,以4000、5000、6000 r/min轉速分別配以10、20 min離心時間,考察不同離心參對菌體存活能力的影響,檢測在不同的離心條件下的離心損失率、離心存活率,從而選取最佳的離心條件,減少菌體的損傷。離心前稱取管體總質量(m2)及離心去上清液后管體總質量(m1),計算每管獲得菌泥質量。計算公式如下:

菌泥質量(g)=m2-m1

離心損失率(%)=上清液活菌總數/發酵液活菌總數×100

離心存活率(%)=菌泥活菌總數/(發酵液活菌總數-上清液活菌總數)×100

1.2.4懸浮基質對冷凍干燥保護效果的影響凍干過程一般在一定的懸浮基質中進行,懸浮溶液的特性在整個凍干過程中對細胞活力有重要影響。以新鮮培養基及10%脫脂奶粉作為懸浮基質,與菌泥混合后加入15.0 mg保護劑/g濕菌。蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇作為凍干保護劑,進行冷凍干燥,測定凍干后菌體存活率,計算方法如下:

菌體存活率(%)=凍干后活菌數(cfu)/凍干前活菌數(cfu)×100

1.2.5真空冷凍干燥方法將巨大芽孢桿菌NCT-2菌懸液放入到低溫冷凍冰箱中進行預凍,凍結完全和形成小冰晶后將預凍好的菌液放入冷阱溫度為-30 ℃的真空冷凍干燥機內凍干22 h。

1.2.6單一保護劑的選擇選取蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、麥芽糊精、海藻糖、甘露醇、甘油作為單一凍干保護劑研究其在凍干過程中對巨大芽孢桿菌NCT-2的保護效果。其中,蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、麥芽糊精的添加濃度分別為0.9、4.8、9.6、14.4 mg保護劑/g濕菌;海藻糖、甘露醇、甘油的添加濃度分別為0.9、2、3.9、9.6 mg保護劑/g濕菌。

1.2.7響應面法優化凍干保護劑配方為了確定最佳的保護劑配方,根據單因素篩選實驗結果,選取蔗糖(X1)、海藻糖(X2)、葡萄糖(X3)三個主要因素為自變量,巨大芽孢桿菌NCT-2菌體存活率為相應指標,采用Box-Behnken方法設計響應面分析實驗,具體設計數據見表1,實驗設計及結果見表3。

表1　NCT-2菌體存活率響應面因素水平表

注:mg/g指mg保護劑/g濕菌。

1.2.8巨大芽孢桿菌NCT-2菌劑的復水取等量的凍干菌劑分別加入井水、河水、雨水稀釋到凍干前原有體積后,放置1 h,測定復蘇后菌體存活率,實驗重復三次取平均值。

1.3數據統計分析

采用Design Expert 8.0軟件完成響應面設計、數據分析、回歸模型建立,應用SAS 9.2軟件對數據進行差異性顯著分析,Origin Pro 8.0 進行作圖。

2　結果與分析

2.1巨大芽孢桿菌NCT-2生長曲線的繪制

以時間為橫坐標,OD660為縱坐標,繪制NCT-2生長曲線,結果如圖1所示。

圖1　巨大芽孢桿菌NCT-2生長曲線Fig.1　The growth curve of B.megaterium NCT-2

由圖1可知,巨大芽孢桿菌NCT-2生長過程中,0～4 h為延遲期,4～20 h為對數期,其中16～20 h為對數末期,20～32 h為穩定期。因此,選取對數末期18 h作為收獲期。

2.2巨大芽孢桿菌NCT-2濃縮離心條件的確定

目前主要有離心、過濾、絮凝等方式進行生物質收獲[8],其中用于菌體濃縮的方法主要是離心分離法。在離心過程中,一方面要注意離心力等因素對菌體存活率的影響,另一方面要保證較高的活菌數量,活菌數會因離心工藝掌握不當而大大降低[9]。

如圖2所示,相同轉速下,隨著離心時間的增加,離心損失率下降,離心存活率也隨之下降,說明雖然增加離心時間可以減少菌體隨上清液的流失,但是對菌體活性的活性也造成了相應的危害。相較離心損失率而言,不同離心時間對菌體存活率影響較大。從經濟角度應選擇較小離心力和較短離心時間,因此選取5000 r/min,10 min離心參數,來保證最佳的離心存活率,此時菌體存活率為75.43%。每組實驗設三個重復取平均值。同時經測三次定取平均值后得知,離心每25 mL發酵液獲菌泥的平均質量為2.10 g。

圖2　不同轉速和離心時間對菌體存活率的影響Fig.2　Different rotational speedand centrifugal effect on bacteria survival rate

2.3不同懸浮基質對冷凍干燥保護效果的影響

凍干前一般將菌泥懸浮在一定基質中,基質不但能給后續微生物生長提供營養,也可以在凍干過程中對微生物起到一定的保護作用[10]。如表2為不同凍干保護劑在新鮮培養基及10%脫脂奶粉中的凍干存活率。

表2　不同懸浮基質中NCT-2凍干存活率

由表2結果可以看出,在四種保護劑中,以新鮮培養基作為懸浮基質的菌體存活率均高于以10%脫脂奶粉為懸浮基質的存活率。有研究表明,雖然Ca2+、Mg2+等離子會使細胞的滲透壓發生改變從而對細胞產生損傷,但是對于一些喜鹽微生物來說,適當濃度的Na+、K+、Mg2+可以保證最大程度的凍干菌體存活率[11]。因此選用新鮮培養基為懸浮基質進行單一凍干保護劑篩選實驗。

2.4單一凍干保護劑篩選

適宜的凍干保護劑可以顯著的提高凍干后的菌體存活率,絕大多數細菌冷凍干燥成功的關鍵在于有效保護劑的使用[12-13]。不同的保護劑及其用量對細菌凍干時保護作用不同,因此需對凍干保護劑的種類及用量進行篩選。如圖3所示,為加入不同種類和濃度的凍干保護劑后巨大芽孢桿菌NCT-2的凍干存活率。

圖3　加入不同種類濃度凍干保護劑后凍干菌體存活率Fig.3　The sruvival rate of bacterica afteradding different cryoprotectants of different concentration

由圖3的結果可以看出,巨大芽孢桿菌NCT-2的存活率在加入保護劑后均有不同程度的提高,保護劑均對巨大芽胞桿菌NCT-2有一定的保護作用。在眾多的保護劑中,海藻糖保護效果最為顯著,凍干保護率達78.8%。蔗糖、葡萄糖、甘露醇等也對巨大芽孢桿菌NCT-2具有良好的保護效果。

有研究表明,海藻糖具有抗凍抗熱的穩定性。海藻糖不僅可以通過與細胞外水分子形成氫鍵來提高細胞內蛋白質的穩定性[14],而且它具有較高的晶體轉換溫度,可以在較高的凍干溫度下保持很好的穩定性[15]。甘露醇一般在凍干過程中作為填充劑使用,它可以產生晶體從而為組分提供物理支撐,且不會與其它成分發生反應[16]。蔗糖可以促進細胞在懸浮液中分散,還可以作為細胞今后生長用的碳源。在冷凍干燥保護劑選擇過程中,要考慮其在凍干菌劑中的溶解性能,還要考慮到成本及后期微生物生長過程中的能源供給問題,額外碳源的添加可以顯著提高微生物冷凍干燥的抗性[17]。

2.5響應面法優化凍干保護劑配方

響應面法RSM是為了找尋多變量體系中最佳的優化條件設計的實驗方案,是一種高效的優化技術[18]。它主要分析研究因素和評價因素之前的相關性和他們之間的相互影響,并建立數學模型,獲得最佳的優化組合,可以提高生產效率,減少支出,獲得科學的結論。

根據單因素實驗結果,選取蔗糖(X1)、海藻糖(X2)、葡萄糖(X3)三個效果最好的主要因素為自變量,菌體存活率為相應指標,采用Box-Behnken的中心組合實驗原理,進行三因素三水平的響應面實驗,共27個析因點和15個區域中心點,每組平行實驗三次,具體設計及結果見表3。

表3　NCT-2菌體存活率BBD實驗設計與結果

軟件分析得到目標響應值與各個因素關系的二階經驗模型:Y=20.67500+13.83072917X1+78.71296X2+8.66753X3-5.69444X1X2-0.45166X1X3-4.14931X2X3-1.24674X12-29.12037X22-0.35807X32。其中,Y為凍干后的菌體存活率,X1為蔗糖,X2為海藻糖,X3為葡萄糖。

表4　二次響應面回歸模型的方差分析結果

注:*差異顯著,p<0.05,**差異極顯著,p<0.01。

保持其中單一因素最優條件,其它兩個因素與響應值的關系由Design Expert 8.0軟件處理得到響應面圖如下圖4所示,可以直觀呈現各因素相互作用影響,從響應面的最高點和等值線可以看出,各因素在所選范圍內存在極值,即響應最高點,這與表4中p值結果一致。在交互項對菌體存活率影響中,蔗糖與海藻糖交互作用對菌體存活率影響極為顯著(p<0.0001),交互作用影響順序為:X1X2>X2X3>X1X3。

根據回歸模型預測出菌體存活率的最高值,當蔗糖濃度為4.51 mg/g,海藻糖濃度0.90 mg/g,葡萄糖9.60 mg/g,預測出的菌體存活率為93.64%。為了檢驗響應面法的可行性,應用該預測配方,實驗經過三次實驗取平均值,測得菌體存活率為91.8%,實際值比預測值誤差為1.96%。因此,響應面法對凍干保護劑的優化是可行的,得到的保護劑配方具有實際應用價值。

圖4　三因子交互作用對NCT-2凍干存活率影響的響應面圖Fig.4　Survival response surface figure of three factors on freeze-dried survival rate of NCT-2

2.6NCT-2凍干菌劑的復水

復水是凍干細胞復蘇重要的一個步驟,復蘇所用的溶劑以及復蘇條件都會影響最后的菌體存活率。一般采用最適合該菌生長的培養液或生理鹽水作為復水介質進行復水[19]。由于用于一般灌溉用水中存在Ca2+、Mg2+等金屬離子,可以滿足細胞復水需要。

圖5　不同復水水質對應的菌體存活率Fig.5　The survival rate of bacteria influenced by water type

圖5結果顯示,經復水后,在井水、雨水、河水中凍干菌劑的存活率分別為90.90%、91.53%、91.27%。可見,不同水質用于凍干菌劑的復水,菌體存活率相差不大。

3　結論

本研究探究了巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑的制備方法,應用離心法收集菌泥,探究不同離心速率及時間對菌體離心損失率及存活率的影響,最終確定了最佳離心條件為5000 r/min,10 min,經探究選定新鮮培養基作為懸浮基質。本研究通過單因素篩選和響應面優化,實驗數據得到的二次響應曲面模型具有較高的回歸率,與實驗結果吻合程度較高,確定了最佳保護劑配方為:蔗糖4.51 mg/g、海藻糖0.90 mg/g、葡萄糖9.60 mg/g。經驗證菌體存活率達91.8%。研究分別采用井水、河水、雨水對制成的菌劑進行復水,結果表明不同類型灌溉水對菌體復水存活率影響不大。

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Preparation ofBacillusmegateriumNCT-2 freeze-dried agent by using response surface methodology

WANG Da-xin1,ZHANG Dan1,*,CHU Shao-hua1,ZHI Yue-e1,2,ZHOU Pei1,2,3,*

(1.School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China;2.Key laboratory of Urban Agriculture(South),Ministry of Agriculture,Shanghai 200240,China;3.Bor.S.Luh Food Safety Research Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

Vacuum freeze-drying method was used to prepareB.megateriumNCT-2 agents,cryoprotectants were optimized using response surface methodology after single factor experiment.Centrifugal conditions,suspension substrate,selection and formulation of cryoprotectants,rehydration water were studied on the impact of survival rate.The results showed that the optimal conditions were 5000 r/min,10 min and fresh media was the better choice as the suspended substrate.Different kinds of water did not had obvious impact on the survival rate after rehydration.Results indicated the optimal amounts of cryoprotectants formula were sucrose 4.51 mg/g,trehalose 0.9 mg/g,glucose 9.60 mg/g.The proven survival rate was 91.8%.

BacillusmegateriumNCT-2;Vacuum freeze-drying;cryoprotectant;response surface methodology

2015-09-25

王大欣(1992-)，女，碩士，研究方向：環境微生物，E-mail：hellodaxin@163.com。

張丹(1988-),女，助理研究員，研究方向:土壤微生物修復，E-mail:zhangdannjut@163.com。

周培(1964-)，男，博士，教授，研究方向：農業生境污染防治與生物修復，E-mail：peizhousjtu@163.com。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)課題(2012AA101405)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.024