白色假絲酵母菌感染大鼠生物膜模型的構建與掃描電鏡觀察

林　偉， 黃金樵， 程金妹

(1福建醫科大學附屬第三醫院耳鼻咽喉科，福州　350108；2莆田學院附屬醫院耳鼻咽喉科；3福建醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科；*通訊作者，E-mail:chengjinmei0687@sina.com)

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白色假絲酵母菌感染大鼠生物膜模型的構建與掃描電鏡觀察

林偉1， 黃金樵2， 程金妹3*

(1福建醫科大學附屬第三醫院耳鼻咽喉科，福州350108；2莆田學院附屬醫院耳鼻咽喉科；3福建醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科；*通訊作者，E-mail:chengjinmei0687@sina.com)

目的構建白色假絲酵母菌感染大鼠體內導管生物膜模型，掃描電鏡觀察其形態結構。方法PVC導管(內徑0.76 mm和外徑1.52 mm )植入大鼠的頸外靜脈，并經導管注入濃度為1×107個細胞/ml 600 μl白色假絲酵母菌懸液；對照組用同樣方法注入生理鹽水。注入菌液24 h后取出導管，截取部分導管的管腔內壁進行掃描電鏡觀察。結果成功構建白色假絲酵母菌感染大鼠體內導管生物膜模型，在掃描電鏡下觀察到導管內表面生物膜的圖像；生物膜呈片狀且密集分布，并由大量致密的細胞外基質包繞酵母細胞形成的具有菌絲交錯的復雜的網狀結構。結論白色假絲酵母菌可在大鼠體內植入物的表面形成生物膜，其空間結構復雜。

白色假絲酵母菌；生物膜；動物模型；掃描電鏡

近年來，白色假絲酵母菌感染病例不斷增多，且逐漸出現對常規抗真菌藥物耐藥，其主要原因之一在于白色假絲酵母菌容易形成生物膜。生物膜是指由細胞外多聚基質以及被其黏結的菌團，換言之，生物膜是一種附著于活組織或無活力組織的表面，由其自身產生的細胞外多聚基質包裹的有結構的菌細胞群體，是微生物在生長過程中為了適應生存環境而形成的一種與浮游細胞相對應的存在形式[1]。它的形成和耐藥機制的復雜性決定了白色假絲酵母菌生物膜相關性感染的臨床治療極為困難。隨著植入性生物醫學材料的應用推廣，如靜脈留置管、人造心瓣膜、氣管插管和氣管切開等，使得白色假絲酵母菌生物膜感染成為院內血液感染的主要原因，所以相關的白色假絲酵母菌生物膜體內感染應引起了人們的關注。

白色假絲酵母菌生物膜模型的構建對于深入研究白色假絲酵母菌生物膜形成機制以及藥物干預具有重要意義。由于臨床上生物膜相關感染則涉及生物膜與機體之間的相互作用，即體內生物膜不會孤立形成，而是與機體免疫系統發生相互作用，因此體內模型的構建對于研究生物膜的形成和耐藥更優于體外模型，具有更為重要的臨床意義。目前根據白色假絲酵母菌在人體常見的感染部位，白色假絲酵母菌生物膜體內模型主要有口腔及義齒、陰道和皮下靜脈導管內3種生物膜構建方法[2,3,4]。前面兩種主要用于反映體內黏膜上的白色假絲酵母菌生物膜的組成和結構，但黏膜上的生物膜結構容易受到體內細菌菌群的影響，其成分可能包括部分的宿主細胞，因此其結構遠較非生物表面生長的生物膜更為復雜。皮下靜脈導管內生物膜模型可模擬植入的醫療材料，該模型可用于評價抗菌劑和生物材料包被的抗菌結果。本實驗旨在設計構建大鼠體內靜脈導管感染白色假絲酵母菌生物膜模型，利用掃描電鏡并觀察生物膜的形態和復雜的空間結構。

1　材料與方法

1.1實驗動物和菌株

清潔級10周齡健康20只雄性SPF級SD大鼠，體重(400±5)g，由上海斯萊克實驗動物公司提供。飼養條件：室溫18-25 ℃，空氣流通，相對濕度40%-70%；動物自由攝食飲水，飼料為鼠顆粒飼料，用于構建大鼠體內白色假絲酵母菌生物膜模型。隨機分成模型組和對照組，每組10只。標準白色假絲酵母菌株：CAF-2，由美國Geotgetown 大學醫學中心提供。

1.2主要試劑及儀器

RPMI 1640，美國Sigma分裝；瓊脂粉，BIOASIA Ltd.；胰蛋白胨(BactoTM Tryptone)，BD公司, 美國；細導管(PVC材料)內外徑分別為0.76 mm和1.52 mm 浙江；超凈工作臺(BCM-1000A型)，蘇州；掃描電子顯微鏡JSM-5310LV(荷蘭PHILIPS公司)；酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)液體培養基(1 000 ml) 國產；肝素鈉(100 U/ml)配制：取100 ml無菌玻璃瓶，抽取1 ml的肝素鈉(12 500 U)原液至玻璃瓶中，加水至62.5 ml。將3根細導管浸泡至已配好的肝素鈉的溶液中，4 ℃過夜，使其肝素化。

1.3菌液的制備

本研究所用白色假絲酵母菌標準株儲存于酵母蛋白胨固體培養基-70 ℃，實驗前1 d 將其轉種于酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)液基中，30 ℃搖床培養過夜。收集菌體并用PBS洗1次，用RPMI1640培養基稀釋，取對數生長期的白色假絲酵母菌，用5中格計數法，將菌液濃度調至1×107個細胞/ml。

1.4大鼠體內導管的置入

在無菌室超凈工作臺下，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，常規消毒頸部皮膚，然后鋪4塊無菌小紗布，巾鉗固定，沿大鼠右頸側皮膚切開，將皮膚用角針固定于紗布上，充分暴露術野，鈍性分離頸前筋膜，暴露頸外靜脈，游離頸外靜脈的近心端和遠心端，分別留置2根4號線，用動脈夾先夾閉近心端的血管，用眼科剪剪開充盈的頸外靜脈一小口，此時靜脈血溢出，沿溢出處迅速插入已肝素化的導管(見到回血，說明導管在血管內，插管成功)，插入的深度距離上腔靜脈和右心房以上2 cm，防止插太深，損傷心臟。用留置線結扎固定，把導管固定在血管上，同時結扎遠心端的留置線，導管末端注入400 μl的肝素鈉(100 U/ml)，防止血液凝固，末端旋緊開關。然后將導管末端縫合固定在皮膚上，紗布外包扎，膠布固定，插管完畢(見圖1)。

圖1　大鼠頸外靜脈導管植入Figure.1　Catheter insertion into the external jugular vein of the rats

1.5實驗模型的構建

導管于感染前12 h放置(預處理),以便與大鼠靜脈血漿蛋白充分作用。預處理后，在超凈工作臺下，旋開導管留置的開關，用1 ml注射器抽吸600 μl 濃度為1×107個細胞/ml的菌液注入導管，再次旋緊導管末端的開關，讓菌液與導管充分作用8 h(真菌與生物材料黏附的過程)，旋開導管開關，用1 ml注射器抽吸未與導管黏附的菌液，再次見到回血，移取300 μl肝素鈉(100 U/ml)注入導管抗凝，旋緊導管末端的開關。注入菌液24 h后抽取出導管，用滅菌PBS溶液反復沖洗導管后，剪取導管近心端3 cm，縱行剖開導管，迅速固定于2.5%戊二醛溶液。

1.6掃描電子顯微鏡的標本處理

參照文獻[5]方法，4 ℃ 2.5%戊二醛溶液固定2 h，PBS溶液沖洗3次，每次1 min，浸于1%鋨酸溶液中，4 ℃靜置2 h；分別用50%、70%、95%和無水乙醇中逐級脫水，每次10 min；醋酸異戊酯置換乙醇20 min，4 ℃以下；臨界點干燥，真空鍍金；掃描電鏡高真空狀態20 kV觀察。

2　結果

掃描電鏡可見白色假絲酵母菌生物膜呈現密集的片狀分布于導管內表面，成熟的生物膜基底部由1-2個細胞厚度的具有代謝活性的芽孢組成，并形成調理膜，在其上方的是相互交織的大量具有代謝活性的菌絲形態的細胞以及生物膜外表面的多糖基質層，最終形成白色假絲酵母菌生物膜是由大量致密的細胞外基質包繞酵母細胞形成的具有菌絲交錯的復雜的空間網狀結構(見圖2)。

A.放大2 000倍　　　　　　　　　　　　　B.放大3 000倍圖2　掃描電鏡下導管內表面白色假絲酵母菌生長24 h生物膜Figure 2　Scanning electron micrograph of Candida albicans biofilms adherent to the intraluminal surface of catheters at 24 h after development

3　討論

本實驗建立大鼠體內靜脈植入導管模型，并借助掃描電鏡觀察白色假絲酵母菌感染大鼠體內成熟生物膜的形態及結構，其最大特點是具有強大的細胞外基質和復雜的空間網狀結構。以上實驗結果與Andes等[6]研究報道結果相似。設計PVC導管模擬人體的中心靜脈置管和部分醫療植入生物材料，植入大鼠頸外靜脈，使得導管表面生長的生物膜直接接觸血液，生物膜在導管內可以獲得更多的營養，考慮到生物膜和宿主之間的相互作用，更貼近臨床實際。本文所建立的大鼠模型，操作方便，可獨立進行并完成整個實驗，可重復性強，可用于開展標本量較大的實驗研究。有文獻[7,8]報道在醫療生物材料中加入表面活性劑如聚環氧乙烷等，或者在表面進行涂層上聚電解質多層膜(PEMs)，以上物質均可減少或者抑制醫療生物材料表面真菌生物膜的形成，這些研究均可應用類似本模型進行相關實驗。因此本實驗模型可被良好地應用于評價抗菌劑和生物材料包被的抗菌結果。

掃描電鏡(SEM)應用于生物膜的檢測[9]，可對超微結構進行觀察，缺點是需要真空的環境及嚴格的脫水制片過程，容易造成樣本的破壞及形成圖像的假象。本實驗不足之處在于由于掃描電鏡的局限性，只能觀察到生物膜圖像的大致表面形態，無法重現生物膜的立體三維結構，有待于將來實驗設計的改進。近年來，激光共聚焦顯微鏡結合熒光技術的使用，克服了上述缺點，通過對生物膜不同層面、不同時間的掃描，結合相應的軟件技術，可重現出生物膜的三維結構和動態變化過程[10]。該技術可以更真實地反應生物膜的性質，有廣泛的運用前景。

白色假絲酵母菌不僅可以在體內植入的醫療生物材料表面形成生物膜，也可單獨或者同時合并細菌在人體內病變的組織黏膜形成生物膜[11]。已有文獻報道[11-13]在口腔黏膜、真菌性陰道炎黏膜、慢性中耳炎和慢性鼻竇炎等病變組織黏膜上觀察到了真菌或者細菌生物膜的感染，因此生物膜感染可能與慢性及復發性感染性疾病關系密切，極有可能在疾病發生、發展、轉歸的過程中發揮了重要的作用。白色假絲酵母菌體內生物膜的實驗研究方面仍面臨著許多亟待解決的問題:比如模擬體內復雜的免疫環境和研究技術手段的完善等，因此探索建立穩定、簡便、更貼近臨床的白色假絲酵母菌體內生物膜模型是今后努力的方向。

[1]Costerton JW,Stewad PS,Greenberg EP.Bacterial Biofilms:common cause of persistent infections[J].Science,1999,284(5418):1318-1322.

[2]Nett JE,Marchillo K,Spiegel CA,etal.Development and val-idation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model[J].Infect Immun,2010,78(9):3650-3659.

[3]Harriott MM,Lilly EA,Rodriguez TE,etal.Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa[J].Microbiology,2010,156(Pt 12):3635-3644.

[4]Ricicová M,Kucharíková S,Tournu H,etal.Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model[J].Microbiology,2010,156(3):909-919.

[5]王端禮.醫學真菌學-實驗室檢驗指南[M].北京：人民衛生出版社,2005:76.

[6]Andes D,Nett J,Oschel P,etal.Development and characterization of an in vivo centralvenous catheter Candida albicans biofilm model[J].Infect Immun,2004,72:6023-6031.

[7]Chandra J,Patel JD,Li J,etal.Modification of surface properties of biomaterials influences the ability of Candida albicans to form biofilms[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(12):8795-8801.

[8]Raman N,Marchillo K,Lee MR,etal.Intraluminal release of an antifungal β-peptide enhances the antifungal and anti-biofilm activities of multilayer-coated catheters in a rat model of venous catheter infection[J].ACS Biomater Sci Eng,2016,2(1):112-121.

[9]Kolodkin-Gal I,Romero D,Cao S,etal.D-amino acids trigger biofilm disassembly[J].Science,2010,328(5978):627-629．

[10]Adav SS,Lin JC,Yang Z,etal.Stereological assessment of extracellular polymeric substances,exo-enzymes,and specific bacterial strains in bioaggregates using fluorescence experiments[J].Biotechnol Adv,2010,28(2):255-280．

[11]Sardi JC,Scorzoni L,Bernardi T,etal.Candida species:current epidemiology,pathogenicity,biofilm formation,natural antifungal products and new therapeutic options[J].J Med Microbiol,2013,62(1):10-24.

[12]侯煒,李曉,肖紅俊.慢性化膿性中耳炎大鼠中耳黏膜的細菌生物膜形成特點及意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2012,26(1):30-33.

[13]尤慧華,諸葛盼,施海明等.慢性鼻-鼻竇炎鼻息肉患者細菌生物膜的觀察[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2011,46(7):547-551.

Construction and scanning electron microscope observation of rat model ofCandidaalbicansbiofilm infection

LIN Wei1, HUANG Jinqiao2, CHENG Jinmei3*

(1DepartmentofOtolaryngology,ThirdAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350108，China;2AffiliatedHospitalofPutianUniversity;3DepartmentofOtolaryngology,FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:chengjinmei0687@sina.com)

ObjectiveTo construct a model of catheter-associated infection withCandidaalbicansbiofilm and observe the morphology and structure of the model under scanning electron microscope.MethodsThe PVC catheter(inner diameter, 0.76 mm; external diameter, 1.52 mm) was inserted into the external jugular vein of the rats. A cell suspension of 1×107yeast cells per millilitre ofCandidaalbicanswas instilled in the catheter in a 600μl volume. The saline solution was given in the same way in control group. The catheters were removed from the rats after 24 h of instilling fungal inoculum in two groups. The intraluminal surface of catheter segments was observed under scanning electron microscopy.ResultsThe rat model ofCandidaalbicansbiofilm infection was constructed successfully. The intraluminal biofilm surface of the catheter was found under scanning electron microscope. The biofilm was patchy in distribution but abundant, which was characterized by both yeast and hyphal cell forms and a network of extracellular matrix strands.ConclusionThe complex structure ofCandidaalbicansbiofilms can exist in the surface of the implants in rats.

Candidaalbicans；biofilm；animal model；scanning electron microscope

福建省教育廳教授基金資助項目(J-S6048)

林偉，男，1983-01生，碩士，主治醫師，E-mail:guaguatong@126.com

2016-05-12

R379

A

1007-6611(2016)08-0729-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.012