K-ras、Livin在不同胃黏膜病變中的表達及臨床意義

孟加榕， 唐忠輝， 溫路生， 劉美蓮， 黃仲慶， 禹　樂

(1中國人民解放軍第一七五醫院病理科,廈門大學附屬東南醫院病理科，漳州　363000； 2漳州衛生職業學院基礎醫學部； *通訊作者,E-mail:tzh6409@126.com)

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K-ras、Livin在不同胃黏膜病變中的表達及臨床意義

孟加榕1， 唐忠輝2*， 溫路生1， 劉美蓮1， 黃仲慶2， 禹樂1

(1中國人民解放軍第一七五醫院病理科,廈門大學附屬東南醫院病理科，漳州363000；2漳州衛生職業學院基礎醫學部；*通訊作者,E-mail:tzh6409@126.com)

目的探討K-ras、Livin在不同胃黏膜組織中的表達，并分析其與胃癌發生發展及預后的關系。方法采用SP免疫組化方法檢測胃癌90例及高級別上皮內瘤變、低級別上皮內瘤變、腸上皮化生、淺表性胃炎、正常胃黏膜各30例的6組不同胃黏膜組織K-ras、Livin表達，進行臨床病理相關性分析。結果①隨著胃組織的病變發展，在淺表性胃炎、腸上皮化生、上皮內瘤變、胃癌中K-ras、Livin的陽性表達率均呈逐漸增加(0,23.3%,28.3%,68.9%,P<0.001; 0,13.3%,23.3%,57.8%,P<0.001)，但低級別上皮內瘤變組低于腸上皮化生組(13.3%vs23.3%;10.0%vs13.3%)，而低級別上皮內瘤變、腸上皮化生、淺表性胃炎、正常胃黏膜四組之間差異不顯著(13.3%,23.3%,0,6.7%,P>0.05;10.0%,13.3%,0,13.3%,P>0.05)，高級別上皮內瘤變明顯高于低級別上皮內瘤變(43.3%vs13.3%,P<0.05;36.7%vs10.0%,P<0.05)。②在90例胃癌中K-ras、Livin陽性表達率顯著高于低級別上皮內瘤變、腸上皮化生、淺表性胃炎和正常胃黏膜(P<0.01)，明顯高于高級別上皮內瘤變(P<0.05)；在胃癌中K-ras、Livin表達與年齡、分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移密切相關(均P<0.05)。③240例不同胃黏膜病變中K-ras與Livin二者之間表達呈正相關(P<0.001)，K-ras(+)Livin(+)者在胃癌浸潤深度T3-T4和淋巴結轉移的比率最高，且明顯高于K-ras(-) Livin(-)者(P<0.05)。結論K-ras、Livin表達均與胃癌的發生發展及預后有關，二者可作為較為理想的腫瘤標志物，用于胃癌早期診斷和轉移的預警。

胃腫瘤；K-ras；Livin；免疫組織化學

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，因其高發病率和高死亡率而成為世界性的頑疾。患者就診時大多屬中晚期，化療緩解率較低，如何對胃癌進行“早期診斷、早期發現、早期治療”是提高胃癌患者生存期的關鍵[1]。胃癌組織學演變過程包括：正常胃組織→淺表性胃炎→腸上皮化生→上皮內瘤變→胃癌。Ras基因是第一個被鑒定的人類癌基因，包括H-ras、K-ras和N-ras，K-ras基因編碼分子21 kD的RAS蛋白，又稱p21基因，其表達異常時，可導致細胞持續生長、抑制細胞凋亡[2]。Livin是最近發現的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，其含有IAPs家族成員所特有的凋亡抑制蛋白重復序列(BIR)和一個羧基端環指結構域(RING結構域)，它與Caspase蛋白結合，抑制其介導級聯激活反應及多種途徑引起的細胞凋亡，在胚胎組織和大多數惡性腫瘤中高表達[3]，較其他IAP成員具有更特殊的地位，因此研究其結構和功能及其作用機制對于腫瘤的發生和發展、抗腫瘤藥物篩選、癌癥的診斷、治療和預后有重要意義。本課題采用SP免疫組化方法檢測240例胃黏膜癌變過程中胃組織K-ras、Livin表達，研究K-ras、Livin在正常胃黏膜、淺表性胃炎、腸上皮化生、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及胃癌中的表達，探討其在胃癌發生發展中的作用及其胃黏膜保護作用的關系，以期為今后胃癌的診斷、預防及基因治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1臨床資料

選取中國人民解放軍第一七五醫院病理科2013-08～2014-07期間隨訪資料完整的原發性胃癌手術切除標本的蠟塊90例，其中男64例，女26例，男 ∶女為2.46 ∶1，年齡43-78歲，中位年齡63歲。溫習全部病例的臨床資料，按消化系統腫瘤WHO(2010年)分類[4]進行組織分型、區域淋巴結轉移分站及TNM分期。另選取胃鏡活檢正常胃黏膜、淺表性胃炎、腸上皮化生、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變的蠟塊各30例，所有患者術前未經過任何抗癌治療。

1.2主要試劑

實驗用兔抗人K-ras多克隆抗體(即用型)、兔抗人Livin多克隆抗體(工作濃度為1 ∶200)及SP免疫組化試劑盒及DAB顯示試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3免疫組化

采用SP方法對組織切片進行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復染，封片，具體操作按照SP試劑盒說明書進行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織切片作陽性對照。

1.4染色結果判斷

采用雙盲法，由兩位病理醫師獨立觀察，若計數相差10%以上重新計數[5]。

K-ras以細胞質內出現淡黃色至棕黃色顆粒為陽性細胞，Livin以細胞質內出現淡黃色至棕黃色顆粒為陽性細胞。采用半定量積分法[6]：根據陽性細胞數和著色深度計分，每例均隨機觀察計數5個高倍視野(×400)，確定其每個視野的陽性率，取平均數，按下列計分：陽性細胞≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，>51%為3分；陽性細胞表達的著色深度：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項積分相乘：0-2分為陰性(-)，>2分為陽性(+)。

1.5統計學方法

用SPSS18.0統計軟件對檢測結果進行統計分析，以α=0.05作為統計學檢驗的顯著性水準。率的比較采用χ2檢驗法或Fisher確切概率法，相關分析用Spearman等級相關。

2　結果

2.1胃癌、癌前病變和正常胃黏膜組織中K-ras、Livin表達

在不同胃黏膜組織中，K-ras陽性染色主要定位于細胞膜或/和胞質(見圖1)，Livin主要定位于細胞質(見圖2)。不同胃黏膜組織病變見圖3 。隨著淺表性胃炎、腸上皮化生、上皮內瘤變和胃癌的病變發展，在胃組織中K-ras、Livin陽性表達分別為0，23.3%，28.3%，68.9%與0，13.3%，23.3%， 57.8%，呈逐漸增加的趨勢，組間比較，總體差異有統計學意義(均P=0.000，見表1)。從表1中可見，低級別上皮內瘤變反而低于腸上皮化生，差異不顯著；高級別上皮內瘤變、胃癌明顯高于低級別上皮內瘤變(P<0.05)；正常胃黏膜、淺表性胃炎、腸上皮化生三者差異不顯著，但明顯低于高級別上皮內瘤變與胃癌(P<0.05)。2.2K-ras、Livin表達與胃癌臨床病理學特征

K-ras、Livin表達在不同年齡、不同分化程度、不同浸潤深度和不同淋巴結轉移各組間比較差異有統計學意義(P<0.05，見表2)，而在不同性別、不同大小和不同TNM分期之間無顯著差異(P>0.05)。

圖1　K-ras蛋白在不同胃黏膜組織中表達 (SP,×100)Figure 1　Expression of K-ras protein in different gastric mucosa lesions (SP,×100)

圖2　Livin蛋白在不同胃黏膜組織中表達 (SP,×100)Figure2　Expression of Livin protein in different gastric mucosa lesions (SP,×100)

圖3　不同胃黏膜組織病變 (HE,×100)Figure 3　Pathology of different gastric mucosa lesions (HE,×100)

表1胃癌、癌前病變和正常胃黏膜組織中K-ras、Livin表達例(%)

Table 1The expression of K-ras and Livin in gastric cancer，precancerous lesion,normal gastric mucosacases(%)

組別nK-ras陽性Livin陽性正常對照302(6.7) 4(13.3) 淺表性胃炎300(0.0) 0(0.0) 腸上皮化生307(23.3) 4(13.3) 低級別上皮內瘤變304(13.3) 3(10.0) 高級別上皮內瘤變3013(43.3)▲▲**△ 11(36.7)▲**#△ 胃癌90 62(68.9)▲▲**##△△★ 52(57.8)▲▲**##△△★

與正常胃黏膜對照比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01 ；與淺表性胃炎比較，*P<0.05，**P<0.01；與腸上皮化生比較，#P<0.05,##P<0.01；與低級別上皮瘤變比較；ΔP<0.05，ΔP<0.01;與高級別上皮瘤變比較，★P<0.05，★★P<0.01

表2K-ras、Livin表達與胃癌臨床病理特征的關系例(%)

Table 2Relationship of expression of K-ras and Livin with clinicopathologic characteristics in gastric cancercases(%)

項目K-ras表達Livin表達n陽性P陽性P性別0.6470.155 男6445(70.3)40(62.5) 女2617(65.4)12(46.2)年齡0.0110.013 <60歲3418(52.9)14(41.2) ≥60歲5644(78.6)38(67.9)大小0.6900.128 <4cm5136(70.6)33(64.7) ≥4cm3926(66.7)19(48.7)分化程度0.0240.007 高中分化4224(57.1)18(42.9) 低分化4838(79.2)34(70.8)浸潤深度0.0000.070 T1-T2186(33.3)7(38.9) T3-T47256(77.8)45(62.5)淋巴結轉移0.0250.017 無3922(56.4)17(43.6) 有5140(78.4)35(68.6)TNM分期0.0770.223 Ⅰ-Ⅱ期3621(58.3)18(50.0) Ⅲ-Ⅳ期5441(75.9)34(63.0)

2.3K-ras、Livin在胃癌組織中共同表達情況與胃癌浸潤轉移的關系

240例胃黏膜癌變過程中胃組織K-ras與Livin二者之間呈正相關關系(rs=0.634,P=0.000)，在90例胃癌中K-ras與Livin二者之間呈正相關關系(rs=0.543,P=0.000)。從表3中可見，K-ras(+)Livin(+)者在浸潤深度T3-T4和淋巴結轉移的比率最高，且明顯高于K-ras(-)Livin(-)者(P<0.01)。

表3胃癌K-ras、Livin共同表達與胃癌浸潤轉移的關系例(%)

Table 3Relationship of co-expression of K-ras and Livin with invasion and metastasis in gastric cancercases(%)

類型nT3+T4淋巴結轉移K-ras(+)Livin(+)4743(91.5)33(70.2)K-ras(+)Livin(-)1513(86.7)7(46.7)K-ras(-)Livin(+)52(40.0)2(40.0)K-ras(-)Livin(-)2314(60.9)9(39.1)P0.0020.047

3　討論

K-ras基因是ras基因家族的成員之一，廣泛存在于人體的多種組織器官中，大約30%的人類腫瘤細胞中出現ras基因突變，其中K-ras在所有人類腫瘤細胞中的突變度最高[7]。 野生型 K-ras在細胞受到生長因子刺激時，與GTP結合在一起，主要通過下游ERK 等途徑調節細胞的功能，但突變型 K-ras 無需上游信號就可持續活化下游通路，使細胞增殖失控，因此與腫瘤細胞的增殖、遷移、擴散密切相關[7]。在胃癌中 K-ras 突變與腫瘤的浸潤、轉移和患者的預后呈負相關[8,9]。國內學者徐曉鳳等[10]研究認為，ras基因在正常胃黏膜和良性病變中均有表達，但在癌中表達增強，與本研究結果一致，即隨著淺表性胃炎、腸上皮化生、上皮內瘤變和胃癌的病變發展，K-ras陽性表達逐漸增加，正常胃黏膜、淺表性胃炎、腸上皮化生和低級別上皮內瘤變四者之間差異不顯著，且高級別上皮內瘤變明顯高于低級別上皮內瘤變，提示K-ras蛋白表達在胃黏膜癌變一個早期分子事件；本研究還發現高級別上皮內瘤變明顯低于胃癌，所以隨訪監測K-ras陽性表達的高危人群，有助于胃癌的早期診斷。胃癌是嚴重危害人類生命健康的惡性腫瘤之一，盡管手術、放療及化療技術在不斷更新，但5 年生存率一直徘徊在50%-60%，腫瘤細胞的侵襲及轉移是胃癌患者高死亡率的重要原因[11]。近年來多數研究發現，K-ras高表達提示癌細胞增生和浸潤能力增強，是癌組織惡性程度高的表現[12]，本研究證實這一結果，K-ras陽性表達與分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移有密切相關，說明K-ras表達預示胃癌有較高的侵襲性和預后不良。

近年來研究表明，惡性腫瘤的發生不僅與癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失有關，還與腫瘤凋亡的抑制有關。細胞凋亡在維持機體自身穩定方面具有重要作用，其在腫瘤的發生發展過程中主要起負調控作用，凋亡抑制是腫瘤的一個普遍特性。Livin是目前研究最新的抑癌基因，主要通過其BIR區與Caspase結合，抑制Caspase活性，尤其抑制Caspase-3，7，9的活性，達到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑而起作用，抑制它們的活性從而抑制細胞凋亡[13]。國內外眾多的研究表明，Livin在胃癌黏膜中呈異常表達，且從黏膜發育不良、早期胃癌到晚期胃癌依次增高。因此，檢測Livin有無突變對胃癌診斷及治療有一定意義[14]。侯毅鞠等[15，16]研究發現Livin蛋白高表達于胃癌組織，在不同分化程度、浸潤度以及有無淋巴轉移組間的表達差異有統計學意義。Livin蛋白高度表達預示腫瘤有較高的侵襲性，可用于判斷胃癌預后。本研究采用SP免疫組化方法檢測不同胃黏膜組織中Livin蛋白的表達，結果發現隨著胃組織的病變發展，Livin的陽性表達均逐漸增加，Livin蛋白在胃癌組織中的陽性表達率(57.8%)顯著高于正常胃黏膜組織(13.3%)、淺表性胃炎(0)、腸上皮化生(13.3%)和低級別上皮內瘤變(10.0%)，提示Livin蛋白表達上調可能在促進胃癌細胞異常增殖和惡性轉化中起著重要作用。同時，高級別上皮內瘤變(36.7%)明顯高于低級別上皮內瘤變、低于胃癌，三者間差異顯著，說明Livin蛋白表達是胃黏膜癌變一個早期分子事件。Livin蛋白的表達與分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移密切相關，這與國內學者馮俊等[17]報道相一致。提示Livin蛋白的持續表達可能進一步參與胃癌的惡性演進過程，且極有可能成為反映胃癌惡性程度的參考指標之一。

腫瘤的發生、發展與細胞增殖和細胞凋亡失衡有關，是多基因參與過程[18]。胃癌的發生和發展是一個有多種基因參與、相互作用的復雜過程。本研究結果發現，在不同胃黏膜病變中K-ras與Livin二者之間表達呈正相關(P<0.01)，K-ras(+)Livin(+)者在胃癌浸潤深度T3-T4和淋巴結轉移的比率最高，且明顯高于K-ras(-)Livin(-)者(P<0.01)，推測K-ras、Livin之間可能相互影響對方的表達，兩者之間存在相互促進作用；并且K-ras、Livin對胃癌的發生、發展存在某種協同“催化”作用，兩者的相互促進作用，加速了胃癌病情的急速發展，加劇了病情惡化。提示K-ras(+)Livin(+)表達的腫瘤細胞具有更強的浸潤和轉移能力，K-ras、Livin二者之間對胃癌發生發展作用機制目前尚未清楚，有待于進一步研究。

由此可見，K-ras、Livin表達均與胃癌的發生發展及預后有關，二者可作為較為理想的腫瘤標志物，用于胃癌的早期診斷和轉移的預警。

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Expression of K-ras, Livin in different gastric mucosa lesions and its clinical significance

MENG Jiarong1,TANG Zhonghui2*, WEN Lusheng1,LIU Meilian1, HUANG Zhongqing2, YU Le1

(1DepartmentofPathology, 175thHospitalofPLA,SoutheastofXiamenUniversityAffiliatedHospital,Zhangzhou363000,China;2FacultyofBasicMedicineinZhangzhouHealthVocationalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:tzh6409@126.com)

ObjectiveTo explore the expression of K-ras and Livin in different gastric mucosa lesions and evaluate its role in occurrence, development and prognosis of gastric cancer.MethodsExpression of K-ras and Livin was detected in 90 cases of gastric cancer,30 cases of high-grade intraepithelial neoplasia,30 cases of low-grade intraepithelial neoplasia,30 cases of intestinal metaplasia, 30 cases of superficial gastritis,30 cases of normal gastric mucosa using SP method. The correlation between expression of K-ras and Livin and clinical pathological features was analyzed.Results①The positive expression rate of K-ras and Livin increased in superficial gastritis, intestinal metaplasia, intraepithelial neoplasia and gastric cancer(0,23.3%,28.3%,68.9%,P<0.001; 0,13.3%,23.3%,57.8%,P<0.001). The positive expression rates of K-ras and Livin were lower in low-grade intraepithelial neoplasia than in intestinal metaplasia(13.3%vs23.3%;10.0%vs13.3%),but there was no significant difference among low-grade intraepithelial neoplasia, intestinal metaplasia,superficial gastritis and normal gastric mucosa(13.3%,23.3%,0,6.7%,P>0.05;10.0%,13.3%,0,13.3%,P>0.05), while the positive expression rates of K-ras and Livin high-grade intraepithelial neoplasia were significantly higher than low-grade intraepithelial neoplasia(43.3%vs13.3%,P<0.05;36.7%vs10.0%,P<0.05). ②The expression rates of K-ras and Livin were both significantly higher in gastric cancer than in low-grade intraepithelial neoplasia, intestinal metaplasia, superficial gastritis and normal gastric mucosa(P<0.01) and high-grade intraepithelial neoplasia(P<0.05).The expression rate of K-ras and Livin was closely related with age, degree of differentiation, tumor invasion depth and lymph node metastasis(P<0.05). ③The expression of K-ras in 240 cases of different gastric mucosa lesions was positively correlated with Livin(P<0.001). The incidences of stage T3-T4of tumor invasion depth and lymph node metastasis were the highest in cases of K-ras(+) and Livin(+) and significantly higher than that in cases of K-ras(-) and Livin(-)(P<0.05).ConclusionThe expression of Livin and K-ras is related to the development and prognosis of gastric cancer,both can be used as ideal tumor markers for early diagnosing gastric cancer and warning metastasis.

gastric carcinoma;K-ras;Livin;immunohistochemisty

福建省教育廳A類科技基金資助項目(JA12436)

孟加榕,男,1971-01生,在讀碩士,副主任醫師，碩士，E-mail:mengjiarong@sina.com

2016-04-19

R735.2

A

1007-6611(2016)08-0742-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.015