PDTC聯(lián)合依達(dá)拉奉干預(yù)下血管性癡呆大鼠腦內(nèi)MCP-1的相關(guān)變化研究

呂曉民,高吉國，周春奎，趙　騰*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130031)

?

PDTC聯(lián)合依達(dá)拉奉干預(yù)下血管性癡呆大鼠腦內(nèi)MCP-1的相關(guān)變化研究

呂曉民1,高吉國2，周春奎2，趙騰2*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130031)

目的探討PDTC聯(lián)合依達(dá)拉奉干預(yù)是否可以通過抑制MCP-1所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來減輕慢性缺血所致大鼠的認(rèn)知功能損害。方法選用Wistar大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、藥物干預(yù)1、2、3組。采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法(2VO)制備慢性前腦缺血致血管性癡呆動物模型，術(shù)后分別用PDTC、依達(dá)拉奉以及PDTC聯(lián)合依達(dá)拉奉對藥物干預(yù)組大鼠進(jìn)行干預(yù)。采用Morris水迷宮對各組大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行檢測。術(shù)后60天應(yīng)用ELISA方法檢測各組大鼠腦內(nèi)MCP-1的表達(dá)。結(jié)果造模后60天模型組、藥物干預(yù)1、2、3組大鼠水迷宮的逃避潛伏期時間與假手術(shù)組相比存在明顯差異，藥物干預(yù)1組及3組分別與模型組相比也存在顯著差異(P<0.05)；經(jīng)ELISA檢測，假手術(shù)組、模型組、藥物干預(yù)1組、藥物干預(yù)2組、藥物干預(yù)3組大鼠腦內(nèi)MCP-1濃度分別為(1.58±0.21)ng/mL、(8.15±1.92)ng/mL、(5.12±1.13)ng/mL、(7.02±1.83)ng/mL、(2.96±0.56)ng/mL。藥物干預(yù)1組、3組分別與模型組相比，t分別為2.256、4.127，差異有顯著性(P<0.05)；藥物干預(yù)3組分別與藥物干預(yù)1組及藥物干預(yù)2組相比，t分別為1.974、3.562，差異均有顯著性(P<0.05)。結(jié)論依達(dá)拉奉聯(lián)合PDTC可能通過不同的途徑來對MCP-1的表達(dá)產(chǎn)生抑制，從而間接抑制MCP-1所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生保護(hù)作用。

血管性癡呆；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽；依達(dá)拉奉；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1257)

血管性癡呆(vasculardementia,VD)是指由腦血管疾病引起的腦損害所致的嚴(yán)重認(rèn)知障礙。目前有研究顯示腦缺血后腦血流量下降所致的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)在血管性癡呆的發(fā)病中起到關(guān)鍵的作用。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)作為一種炎癥趨化因子，在腦缺血過程中可趨化和激活T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞，同時可活化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而對神經(jīng)細(xì)胞造成損傷。MCP-1的表達(dá)可受多種因素的調(diào)節(jié)，吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)和自由基清除劑可以在不同的途徑對MCP-1的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控[1]。因此，應(yīng)用PDTC和依達(dá)拉奉作為干預(yù)劑可能會抑制MCP-1的表達(dá)。本研究通過應(yīng)用PDTC和依達(dá)拉奉進(jìn)行干預(yù)，對慢性缺血致血管性癡呆大鼠腦內(nèi)MCP-1的相關(guān)表達(dá)進(jìn)行研究，旨在明確依達(dá)拉奉聯(lián)合PDTC是否可以通過對MCP-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響來減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷，從而參與對認(rèn)知功能的保護(hù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物

選取雄性Wistar大鼠60只(體重250-300g,鼠齡2-3個月)，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供及喂養(yǎng)，實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(吉)2014-0006，實驗動物使用許可證:SYXK(吉)2014-0022，動物實驗在吉林大學(xué)基礎(chǔ)實驗室進(jìn)行。

1.2模型制備及藥物干預(yù)

在分組之前對大鼠先進(jìn)行Morris水迷宮檢測。60只大鼠平均逃避潛伏期為 31.85±9.23s。將大鼠隨機分為假手術(shù)對照組(12只),模型組(12只)，藥物干預(yù)1(12只),藥物干預(yù)2組(12只)，藥物干預(yù)3組(12只)。采用雙側(cè)頸總動脈持久性結(jié)扎法(2VO)復(fù)制慢性前腦缺血致血管性癡呆的動物模型。假手術(shù)對照組除不結(jié)扎、不剪斷頸總動脈,其余過程與模型組及藥物干預(yù)組相同。

造模后，給予藥物干預(yù)1組每3天腹腔注射PDTC(碧云天生物技術(shù)研究所)(50mg/kg)，藥物注射間隔的2天每天注射等量生理鹽水1次。藥物干預(yù)2組每天腹腔注射依達(dá)拉奉(南京先聲制藥)(6mg/kg)，藥物干預(yù)3組腹腔同時注射PDTC及依達(dá)拉奉，方法同前兩組。假手術(shù)組及模型組每天給予等量的生理鹽水腹腔注射。造模后60天，分別對假手術(shù)組、模型組、藥物干預(yù)1、2、3組進(jìn)行水迷宮試驗，再次記錄各組的逃避潛伏期時間。

1.3MCP-1的方法測定

水迷宮測試后，將假手術(shù)組、模型組及藥物干預(yù)組大鼠斷頭取腦，提取腦組織勻漿，根據(jù)ELISA試劑盒提供的方法進(jìn)行腦組織MCP-1檢測。

1.4統(tǒng)計方法

2　結(jié)果

2.1Morris水迷宮試驗結(jié)果

經(jīng)水迷宮試驗后假手術(shù)組死亡1只，剩余11只，第4d逃避潛伏期均小于20s，未有誤入盲端者。模型組死亡4只，符合血管性癡呆標(biāo)準(zhǔn)者8只。藥物干預(yù)1組死亡1只，第4d逃避潛伏期低于20s者3只，其余8只逃避潛伏期均大于20s，符合血管性癡呆的標(biāo)準(zhǔn)。藥物干預(yù)2組死亡2只，第4d逃避潛伏期低于20s者3只，其余7只逃避潛伏期均大于20s，符合血管性癡呆的標(biāo)準(zhǔn)。藥物干預(yù)3組死亡1只，逃避潛伏期低于20s者8只，逃避潛伏期大于20s者3只。

將造模前后大鼠逃避潛伏期時間分別進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)造模前模型組及藥物干預(yù)1、2、3組分別與假手術(shù)組對比，差異均無顯著性(P>0.05)。(見表1)

表1　造模前水迷宮逃避潛伏期比較

表2　造模后水迷宮逃避潛伏期比較±s，s)

造模后，把模型組、藥物干預(yù)1組、藥物干預(yù)2組、藥物干預(yù)3組第64天逃避潛伏期時間與假手術(shù)組相比，t分別為3.325、2.215、2.386，差異均有顯著性(P<0.05)；藥物干預(yù)3組第64天逃避潛伏期與假手術(shù)組相比，t=1.136,差異無顯著性(P>0.05)。藥物干預(yù)1組與模型組相比，t=1.126，差異無顯著性(P>0.05)；藥物干預(yù)2組與模型組相比，t=0.896，差異無顯著性(P<0.05)。

2.2MCP-1檢測結(jié)果

表3　各組 MCP-1表達(dá)的比較

藥物干預(yù)1組、3組分別與模型組相比，t分別為2.256、4.127，差異有顯著性(P<0.05)；而藥物干預(yù)2組與模型組相比，t=0.586，差異無顯著性(P>0.05)。藥物干預(yù)3組分別與藥物干預(yù)1組及藥物干預(yù)2組相比，t分別為1.974、3.562，差異均有顯著性(P<0.05)。

3　討論

血管性癡呆主要是由缺血性、缺氧性、出血性腦血管病等導(dǎo)致腦組織損害引起的，臨床以認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)能力和記憶力衰退以及行為障礙等為主要表現(xiàn)的一組疾病[2]。對于血管性癡呆的發(fā)病機制，目前尚無確切定論。目前越來越多的研究顯示腦缺血后炎癥反應(yīng)參與了對神經(jīng)元的損傷，從而對認(rèn)知功能造成影響[3]。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein，MCP-1)是由76個氨基酸殘基組成的分子量為15 kD的糖蛋白單鏈，是具有趨化功能的細(xì)胞因子，屬于趨化因子中的CC亞族。作為一種重要的炎性趨化因子，MCP-1在正常腦組織中表達(dá)很少，但是當(dāng)腦組織缺血后，腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等均可以產(chǎn)生大量MCP-1[4]。另一方面，在腦缺血后引起的炎癥反應(yīng)，MCP-1反過來可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞及血液中的單核-巨噬細(xì)胞向病變的炎癥部位聚集，進(jìn)而可能造成局部腦組織的損傷。既往研究顯示,在腦缺血急性期MCP-1多出現(xiàn)一個表達(dá)高峰[5，6]。但最近有研究顯示[7],在腦缺血后MCP-1會在急性期過后出現(xiàn)第二個表達(dá)高峰，并且持續(xù)高表達(dá)較長時間。另有研究顯示[8]，MCP-1的表達(dá)隨著動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度而出現(xiàn)依賴性高表達(dá)。我們的試驗結(jié)果顯示在持續(xù)缺血60天后，模型組大鼠腦內(nèi)MCP-1的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，也進(jìn)一步證實了MCP-1在慢性缺血致腦損傷的炎癥反應(yīng)中可能起到關(guān)鍵作用。因此，我們猜測，在MCP-1表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行拮抗，有可能阻礙腦缺血后MCP-1在腦內(nèi)的表達(dá)，從而減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)對腦組織的損傷。

目前已知在MCP-1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過程中，其可調(diào)控區(qū)有兩個區(qū)域可以與NF-κB結(jié)合，分別稱為κB1、κB2區(qū)。這兩個區(qū)包繞另外一個高敏感區(qū)DMS(HS)共同調(diào)控MCP-1的表達(dá)[1]。因此，作為MCP-1調(diào)控的上游核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB可以作為MCP-1表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點。一般情況下，NF-κB與其抑制性蛋白(inhibitor κB，IκB)結(jié)合在一起，處于非活性狀態(tài)。當(dāng)缺血缺氧及自由基等刺激出現(xiàn)時，NF-κB即與IκB分離，從而進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其活性。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)被認(rèn)為是NF-κB的特異性抑制劑，其主要作用機制是通過抑制IκB的磷酸化，從而抑制其降解，減少NF-κB的亞基P65/P50的入核，從而使其下游信號分子的表達(dá)隨之下調(diào)。因此我們選擇PDTC作為干預(yù)劑通過抑制NF-κB的活性來下調(diào)MCP-1的表達(dá)。實驗結(jié)果顯示單獨應(yīng)用PDTC可使慢性缺血大鼠腦內(nèi)MCP-1的表達(dá)較模型組明顯降低，且認(rèn)知功能損害較對照組也明顯減輕。除了應(yīng)用PDTC對NF-κB產(chǎn)生直接抑制外，減少缺血后的NF-κB活化因素可能是抑制MCP-1表達(dá)的另外一個途徑。自由基過多被認(rèn)為缺血后神經(jīng)損傷的一個重要因素，而自由基與NF-κB可以相互促進(jìn)各自的表達(dá)，從而形成正反饋，被認(rèn)為是缺血后神經(jīng)損傷的一個重要機制[9]。依達(dá)拉奉是最常用的自由基清除劑，因此我們應(yīng)用依達(dá)拉奉作為干預(yù)劑，對慢性腦缺血大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示單獨應(yīng)用依達(dá)拉奉可以輕度降低慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)MCP-1的表達(dá)，但較模型組無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，且大鼠認(rèn)知功能較對照組無明顯改善。當(dāng)依達(dá)拉奉聯(lián)合PDTC干預(yù)時，慢性缺血大鼠腦內(nèi)MCP-1表達(dá)較對照組顯著降低，較單獨應(yīng)用PDTC或單獨應(yīng)用依達(dá)拉奉時腦內(nèi)MCP-1表達(dá)下降更為明顯，且差異有顯著性。另外，聯(lián)合應(yīng)用依達(dá)拉奉及PDTC組大鼠水迷宮逃避潛伏期時間也較其他各組明顯縮短，從而提示該組大鼠認(rèn)知功能損害較其他各組明顯減輕。因此我們認(rèn)為，依達(dá)拉奉和PDTC可以通過不同的途徑來對MCP-1的上游調(diào)控因子NF-κB產(chǎn)生抑制，從而間接抑制MCP-1的表達(dá)。依達(dá)拉奉聯(lián)合PDTC可能就是通過以上對MCP-1的表達(dá)抑制機制來減輕慢性缺血致血管性癡呆大鼠腦中炎癥反應(yīng)，從而對大鼠的認(rèn)知功能產(chǎn)生保護(hù)作用。

[1]Kumar SN，Boss JM．Site A of the MCP-1 distal regulatory region functions as a transcriptional modulator through the transcription factor NF1[J].Mol Immunol,2000,37(11):623.

[2]李林昕,董強.從血管性癡呆到血管性認(rèn)知功能損害[J].中華腦血管病雜志(電子版),2009,3(3):25.

[3]Basu A,Lazovic J,Krady JK,et al.Interleukin-1and the interleukin-1 type 1 receptor are essential for the progressive neurodegeneration that ensues subsequent to a mild hypoxic/ ischemic injury [J].J Cereb Blood Flow Metab,2005,25(1):17.

[4]Paolinelli R,Corada M,Orsenigo F,et al.The molecular basis of the blood brain barrier differentiation and maintenance[J]．Pharmacol Res，2011,63:165.

[5]Abbott NJ,Patabendige AA,Dolman DE,et al.Strcutue and function of the blood-brain Barrier[J].Neurobiol Dis,2010,37:13.

[6]夏英凱,杜怡峰，李運剛.急性腦梗死患者血清MCP-1水平的變化[J]．山東醫(yī)藥,2016,01(56):79.

[7]王敏,曹秉振.慢性低灌注大鼠血清及腦組織中MCP-1及IL-8的表達(dá)[J]中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2012,6(29):506.

[8]李世英,李崢,等.單核細(xì)胞趨化蛋白1和血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白水平與腦梗死進(jìn)展及頸動脈粥樣硬化的關(guān)系[J].中華老年心腦血管病雜志，2016,1:87.

[9]Wang J,Si Y,Wu C,et al.Lipopolysaccride promotes lipid accumulation in human adventitial fibrobalsts via TLR4-NF-κB Pathway[J].Lipid in health and disease,2012,(11)1:139.

The study of MCP-1 change in the brain of vascular dementia rats under the intervention of edaravone jointed PDTC

LU Xiao-min,GAO Ji-guo,ZHAO Teng,et al.

(1.Department of Neurology,The First Hospital of Ji Lin University,Changchun 130021,China;2.Department of Neurology,The Part Two of The First Hospital of Ji Lin University,Changchun 130031,China)

ObjectiveToinvestigatewhetheredaravonejointedPDTCcaninhibitinflammatoryresponsemediatedbytheMCP-1toreducethecognitiveimpairmentcausedbychronicischemiainrats.MethodsChoose60maleWistarratsanddividedintomodelgroup,druginterventiongroup1,druginterventiongroup2,druginterventiongroup3andthecontrolgrouprandomly.Applicatedthepermanentligationbilateralcommoncarotidarteriesmethod(2VO)topreparethechronicforebrainischemiaanimalmodelofvasculardementia.Postoperative，intraperitonealinjectedPDTC,edaravoneandedaravonejointedPDTCintodruginterventiongroupratsrespectively.UsingMorriswatermazeoneachgroupratsinbeforeandafteroperationtomeasuretheescapelatencytoresponsethecognitvefunction.UsedofELISAtomeasuretheMCP-1expressioninbrainofeverygroup.ResultsComparedtheescapelatencytimeofdruginterventiongroup1,2,3andmodelratsrespectivelycomparedwithcontrolgroupwithcontrolgroupaftermodelbuilding60days,differencesweresignificant;Druginterventiongroup1and3,respectively,comparedwithmodelgroup,differencesweresignificant.TheMCP-1concentrationofcontrolgroup,modelgroup,druginterventiongroup1,2,3detectedbyELISAwas(1.58±0.21)ng/mL、(8.15±1.92)ng/mL、(5.12±1.13)ng/mL、(7.02±1.83)ng/mL、(2.96±0.56)ng/mLrespectively.Druginterventiongroup1,3,respectively,comparedwithmodelgroupwas2.256,4.127,differencesweresignificant(P<0.05);Druginterventiongroup3,respectively,comparedwithdruginterventiongroup1,2,twas1.974and3.562respectively,differencesweresignificant(P<0.05).ConclusionEdaravonejointedPDTCcaninhibittheexpressionofMCP-1sothattoinhibittheinflammatoryresponseindirectlymediatedbytheMCP- 1,socanprotectthelearningandmemoryfunctionofvasculardementiarats.

vasculardementia；pyrrolidinedithiocarbamate；edaravone；monocytechemotacticprotein-1

1007-4287(2016)08-1257-04

R446.6

A

2015-11-25)