黃連等對假絲酵母菌的體外抑菌研究

吳　亞,劉東梅,郄會卿,楊翠娥

(1.河北省中醫院,河北 石家莊050011;2.寧晉縣中西醫結合醫院,河北 寧晉縣055550)

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黃連等對假絲酵母菌的體外抑菌研究

吳亞1,劉東梅1,郄會卿1,楊翠娥2

(1.河北省中醫院,河北 石家莊050011;2.寧晉縣中西醫結合醫院,河北 寧晉縣055550)

隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑以及侵入性診斷治療普遍應用，深部真菌感染的發病率日益增加，我院假絲酵母菌分離率居所有感染菌的第五位。但目前臨床上應用的西藥抗真菌藥物，存在毒性大、費用高、耐藥性增加等缺點。不少學者致力于中藥的抗細菌、抗真菌方面的研究，筆者對黃連、茵陳、黃芪進行了體外抑菌試驗，尋求中藥在抗真菌感染方面的功效，旨在能更好的服務和指導臨床用藥。

1　材料

1.1菌株

2013年3月至2014年3月河北省中醫院微生物室分離的假絲酵母菌104株，其中白假絲酵母菌48株，熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌各20株，近平滑假絲酵母菌12株，葡萄牙假絲酵母菌4株，菌株分別來自患者的血液、中段尿和痰液標本。

1.2培養基

①RPMI1640液體培養基：將RPMI1640粉末20.8 g，葡萄糖40 g，用0.33M三嗎琳基丙磺酸(MOPS)緩沖液溶解，同時用1M NaOH調整PH值至6.9-7.1，最后定容至1L，過濾除菌備用。②4%瓊脂 將40 g瓊脂溶于1 000 ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

1.3藥液儲存液制備

取各中藥材100 g，加適量蒸餾水浸泡30 min,強火加熱煮沸，再以文火煎煮30 min，紗布過濾，濾渣再加適量蒸餾水煎煮30 min，過濾棄渣，合并濾液，加熱濃縮到0.1 L，即相當于原生藥1 000 g/L。121℃高壓滅菌20 min，-20℃冰箱保存備用。

1.4主要儀器和試劑

①高壓蒸汽消毒鍋：日本三洋株式會社；②電熱恒溫培養箱：南京建成儀器有限公司；③比濁儀：法國梅里埃生物制品公司；④MIT-P多點接種儀：日本佐久間制作所；⑤沙保羅平板、瓊脂粉、葡萄糖均購自杭州天和微生物試劑有限公司；⑥ RPMI1640粉：美國Life Technologies Inc產品；⑦MOPS粉：Fluka公司產品； ⑧黃連、茵陳、黃芪：均購于河北省藥材公司。

2　方法

采用瓊脂稀釋法，對黃連、茵陳、黃芪進行定量抑菌試驗。

2.1藥物平板制備

將RPMI1640液體培養基與4%瓊脂于60℃ 1∶1混勻，分裝入試管中，每管分裝18 ml,仍置60℃保溫。將倍比稀釋后的不同濃度的中藥液2 ml加于試管中，輕輕振搖混勻，倒入直徑90 mm平皿，置水平桌面使之凝固，最終配制成含中藥濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 g/L的藥物平板，并設不含中藥的瓊脂平板為生長對照，不接種菌液且不含中藥的瓊脂平板做空白對照。

2.2菌懸液制備

將104株受試菌和質控菌株(白假絲酵母菌90028)在沙保羅平板連續傳代培養2次，以確保菌落的純化和活力，第2次35℃傳代培養48 h后取培養菌落用無菌生理鹽水分別配制成0.5麥氏比濁的菌懸液。

2.3培養與觀察

用MIT-P多點接種儀將配制好的0.5麥氏比濁菌懸液10 μl接種于含不同中藥濃度的藥物平板和生長對照平板上，于35℃培養48 h，如果生長對照平板假絲酵母菌全部生長且空白對照平板無假絲酵母菌和雜菌生長，則觀察含中藥各藥物平板的最低抑菌濃度(MIC)，并統計出MIC50和 MIC90的藥物濃度和累積抑菌百分率。

3　結果

3.1黃連、茵陳和黃芪對假絲酵母菌的抑菌作用

通過對104株假絲酵母菌進行體外抑菌試驗，結果表明黃連的抑菌效果很好，MIC范圍在0.39 g/L-25.00 g/L之間，MIC50和 MIC90分別為1.56 g/L和6.25 g/L，茵陳的抑菌效果最差。結果見表1。

3.2黃連、茵陳和黃芪對各種假絲酵母菌的抑菌作用

黃連對熱帶假絲酵母菌的抑菌效果最好，MIC范圍在0.39 g/L-1.56 g/L之間，其次為光滑假絲酵母菌(0.78 g/L-3.12 g/L)、白假絲酵母菌(0.78 g/L-3.12 g/L)和葡萄牙假絲酵母菌(3.12 g/L-6.25 g/L)，對近平滑假絲酵母菌(6.25 g/L-25.00 g/L)也有一定的抑菌作用。黃芪僅對熱帶假絲酵母菌有一定抑制作用。未檢出茵陳的抑菌作用。結果見表2。

4　討論

近年來隨著抗生素、激素、免疫抑制劑等藥物以及介入治療的廣泛應用，臨床上真菌感染的比例大大增加，對抗真菌藥物的耐藥問題也越來越突出。本試驗為了尋求單味中藥在抑制真菌方面的功效，采用瓊脂稀釋法對104株臨床分離的假絲酵母菌菌株進行了體外抑菌試驗。瓊脂稀釋法有很多優點，可同時測定多個菌株，易于確定終點，比液體稀釋法重復性好[1]。宋波[2]等曾采用瓊脂稀釋法對苦參、黃芩、烏梅對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌進行定量抗菌實驗，檢出烏梅對白假絲酵母菌抑菌作用較好。

表1　黃連等對104株假絲酵母菌的累積抑菌率比較(%)

注：*MIC50所在藥物瓊脂平板的中藥濃度；△MIC90所在藥物瓊脂平板的中藥濃度。

表2　黃連等對各種假絲酵母菌的MIC范圍(g/L)

本研究通過瓊脂稀釋法體外抑菌試驗發現，黃連對假絲酵母菌具有較強的體外抑菌作用，其MIC范圍在0.39 g/L-25.00 g/L之間，MIC50 和MIC90分別為1.56 g/L和6.25 g/L。對熱帶假絲酵母菌抑菌作用最強，MIC范圍在0.39 g/L-1.56 g/L之間，對白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和葡萄牙假絲酵母菌次之，對近平滑假絲酵母菌也有較強的抑菌作用。其中對白假絲酵母菌的MIC范圍在0.78 g/L-3.12 g/L，其比王文花等[3]報道黃連提取液對白色念珠菌具有較強的體外抑菌效果，其 MIC 為6.25 g/L還要低。和劉濤峰等[4]報道黃連對白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌等的標準菌株均有較強的抑菌作用一致。黃連主含小檗堿(黃連素)，含量高達50%，小檗堿對白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌的生長均具抑制作用[5]。水提黃連與醇提黃連對白念珠菌都有較強的抑菌作用[6];黃芪能使血液中白細胞顯著增加，網狀內皮系統的吞噬功能增強，從而使機體非特異性抵抗力增加。黃芪能促進抗體合成，對體液免疫有促進作用，還有誘生干擾素的作用，使其免疫功能增強[7]。本試驗中發現黃芪僅對熱帶假絲酵母菌有一定的抑菌作用，對其它假絲酵母菌未發現有抑菌作用[8]；未檢出茵陳對假絲酵母菌有抑制作用，這與某些研究[9]報道茵陳的揮發油茵陳炔酮在試管內能抑制皮膚病原性真菌的生長結果不一致，這可能與中藥的提取方式有關。本試驗用的是水煎劑，有些具有抑制真菌作用的成分可能不溶于水，或者煎煮時不耐受高溫而被破壞或揮發，影響了抑菌效果，這些有待于進一步研究和改進。總之，中藥在抑制真菌方面的作用前景可觀，除小檗堿抗真菌作用較強外，也有報導黃芩苷、苦參堿等中藥成分抗真菌能力也很強[10]，這些提純后的中藥成分有待于通過大量動物試驗和臨床研究來拓展中藥抗真菌的這一功效。

[1]周寧,張建新,樊明濤,等.細菌藥物敏感性實驗方法研究進展[J].食品工業科技,2012,33(9):459.

[2]宋波,劉颋,呂麗艷,等.苦參、黃芩、烏梅對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌抗菌活性的研究[J].中國微生態學雜志,2010,(22)6:507.

[3]王文花,李勁松,肖晴晴,等.5 種中藥體外抗白色念珠菌的實驗研究[J].廣西中醫學院學報,2010,13(3):54.

[4]劉濤峰,鄭玉榮,劉小平,等.10種中藥水煎劑對念珠菌的體外抑菌作用[J].安徽中醫學院學報,2012,21(4):72.

[5]周笑梅,寧玉梅.單味中藥抑制白假絲酵母菌作用的研究進展[J].中華中醫藥學刊,2011,29(3):580.

[6]王玲,呂雪蓮,孫令,等.中藥提取物對酵母菌抗真菌活性研究[J].中國真菌學雜志,2009,4(1):16.

[7]辛洪濤,侯林江,徐少華,等.玉屏風散的免疫藥理研究進展[J].中國中藥雜志,1998,23(8):57.

[8]于軍.中藥抗真菌的實驗研究[D].吉林大學,2007.

[9]董巖,王新芳,崔長軍,等.茵陳蒿的化學成分和藥理作用研究進展[J].時珍國醫國藥,2008,19(4):874.

[10]鄭玉榮,劉濤峰,張虹亞,等.中藥成分抗白念珠菌的實驗研究進展[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志,2011,10(6):399.

河北省中醫藥管理局科研計劃項目(編號2013048)

1007-4287(2016)08-1276-02

吳亞(1975-)，女，碩士學位，副主任技師，主要從事臨床微生物檢驗研究。

2015-07-21)