依達拉奉對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用

高雪花，艾宇航

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)Ⅱ科，甘肅 蘭州 730030；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410008）

論著

依達拉奉對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用

高雪花1，艾宇航2

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)Ⅱ科，甘肅 蘭州 730030；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410008）

目的觀察依達拉奉對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用。方法78只清潔級SD大鼠隨機分為正常組（Norm組）、假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）、小劑量依達拉奉治療組（ED 1組）（3mg/kg，靜脈注射）及大劑量依達拉奉治療組（ED2組）（6mg/kg，靜脈注射）。盲腸結(jié)扎穿孔法制作膿毒癥模型，ED1組及ED2組給予依達拉奉治療。分別于術(shù)后3、6及12 h檢測各組血清cTn I和心肌·OH-、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子（TNF-α）及白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平，并觀察心肌病理形態(tài)改變。結(jié)果Norm組與Sham組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CLP組與Norm組及Sham組比較，cTn I、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明顯升高，SOD水平明顯降低（P＜0.01）；ED 1組及ED 2組與CLP組比較cTnI、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明顯降低，SOD水平明顯升高（P＜0.01）；ED 2組與ED 1組比較，cTn I、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明顯降低，SOD水平明顯升高（P＜0.01）。CLP組心肌病理學(xué)改變包括間質(zhì)充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，心肌纖維斷裂、壞死；ED1組及ED2組心肌損傷較CLP組明顯減輕。結(jié)論①依達拉奉能減輕膿毒癥心肌損傷，機制可能與抑制氧化應(yīng)激及下調(diào)炎癥因子水平有關(guān)；②大劑量依達拉奉（6mg/kg）對膿毒癥心肌損傷的保護作用較小劑量（3mg/kg）更明顯。

膿毒癥；心肌損傷；氧化應(yīng)激；炎癥因子；依達拉奉

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，如合并一個或一個以上器官功能障礙/組織低灌注或低血壓則稱為嚴(yán)重膿毒癥，進一步發(fā)展可致膿毒癥休克［1］，其發(fā)病率和死亡率均很高，是ICU內(nèi)非心臟病患者的主要死因。心肌損傷是膿毒癥常見的并發(fā)癥，也是影響膿毒癥預(yù)后的重要因素，有效防治心肌損傷對改善膿毒癥預(yù)后有重要的意義［2］。然而膿毒癥心肌損傷具體機制至今仍不明確，大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激及炎癥因子可能為重要的致病因素［3-4］。依達拉奉（edaravone）是一種作用機制明確的氧自由基清除劑，在腦梗死及心肌缺血再灌注損傷領(lǐng)域已做了大量的研究［5］。本研究旨在觀察依達拉奉對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

清潔級雄性SD大鼠78只，體重（270±20）g，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院實驗動物中心。大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、腫瘤壞死因子（TNF-α）及白細(xì)胞介素1β（IL-1β）定量ELISA試劑盒（R&D，美國）和大鼠·OH-、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自長沙賽晶生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組與模型制備將78只SD大鼠隨機分為正常組（Norm組）、假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）、小劑量依達拉奉治療組（ED1組）及大劑量依達拉奉治療組（ED2組）。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）制備膿毒癥模型［6］：10%水合氯醛3m l/kg行腹腔內(nèi)麻醉，固定、消毒、鋪巾，腹前正中切口2～3 cm，游離腸系膜和盲腸，以3.0絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，9號針頭在結(jié)扎線下5mm處貫穿盲腸2次，擠壓腸管使糞便自穿刺點溢出，還納腸管后逐層縫合關(guān)腹。ED1組及ED 2組在CLP造模后立即尾靜脈分別注射依達拉奉3mg/kg、6mg/kg。Sham組除不結(jié)扎和穿刺盲腸外，其余操作同CLP組。術(shù)畢各組皮下注射生理鹽水30ml/kg以補充體液丟失。

1.2.2標(biāo)本留取與指標(biāo)檢測血清cTnI：術(shù)后3 h、6 h、12 h水合氯醛腹腔麻醉后，開腹自腹主動脈抽血，3 000 r/min離心15min，上清液置入-20℃冰箱保存。按試劑盒說明書酶聯(lián)免疫吸附法測定。心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)：①自腹主動脈抽血后立即開胸取心肌組織，冰生理鹽水洗凈血液后濾紙吸干，放入Ependoff管置入-70℃冰箱保存；②在冰水浴中制備心肌勻漿，4 000 r/min離心15min，上清液按試劑盒說明書測定·OH-、MDA和SOD。心肌炎癥因子：上步所得心肌勻漿，按試劑盒說明酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α及IL-1β。心肌病理學(xué)觀察及病理積分：①取一塊右心室壁組織，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察心肌病理形態(tài)變化；②Kishimoto法計算心肌病變積分：每張切片取5個高倍視野，計算每個視野中炎癥細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個視野的面積之比，無病變計0分，＜25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分。對心肌病理學(xué)變化的評估遵循雙盲法原則。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（QL-QU）表示，2組間比較用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比/率表示，兩組間比較用χ2檢驗；Pearson相關(guān)分析檢驗相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血清中cTn I的變化

血清中cTnI的變化見表1：Norm組與Sham組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CLP組各時間點均明顯高于Norm組及Sham組（P＜0.01）；ED 1組及ED 2組較CLP組明顯降低（P＜0.01）；ED 2組較ED 1組明顯降低（P＜0.01）。

2.2心肌中·OH-、MDA和SOD的變化

心肌中·OH-、MDA和SOD的變化見表2：Norm組與Sham組心肌中·OH-、MDA和SOD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Norm組及Sham組比較，CLP組心肌·OH-及MDA水平3 h即明顯升高，6 h達到高峰，之后有所降低，SOD水平明顯降低（P＜0.01）；ED 1組及ED 2組心肌·OH-及MDA水平較CLP組明顯降低，SOD水平明顯升高（P＜0.01），但與Norm組及Sham組比較，ED 1組及ED 2組心肌·OH-及MDA水平明顯升高，SOD水平明顯降低（P＜0.01）；ED 2組與ED 1比較，心肌·OH-及MDA水平明顯降低，SOD水平明顯升高（P＜0.01）。

2.3心肌中TNF-α和IL-1β的變化

心肌中TNF-α和IL-1β的變化見表3：Norm組與Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Norm組及Sham組比較，CLP組6 h明顯升高，12 h有所下降（P＜0.01）；ED1組及ED2組較CLP組明顯降低（P＜0.01），但較Norm組及Sham組明顯升高（P＜0.01）；ED2組較ED1組明顯降低（P＜0.01）。

2.4心肌病理形態(tài)學(xué)改變

2.4.1心肌病理形態(tài)學(xué)改變Norm組及Sham組無明顯病理改變（見圖1）；LPS組間質(zhì)充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，心肌纖維斷裂（見圖2）；ED1組及ED2組上述病理改變明顯減輕（見圖3、4）。

表1　血清中cTn I濃度比較 （n=6，）

表1　血清中cTn I濃度比較 （n=6，）

注：1）與Norm組及Sham組比較，P＜0.01；2）與CLP組比較，P＜0.01；3）與ED1組比較，P＜0.01

組別cTn I/（pg/ml）Norm組0.66±0.05 Sham組3 h 0.66±0.05 6 h　0.66±0.06 12 h　0.65±0.05 CLP組3 h 2.01±0.161）6 h　4.08±0.231）12 h　6.48±0.311）ED1組3 h 1.82±0.101）2）6 h　2.51±0.121）2）12 h　3.24±0.131）2）ED2組3 h 1.48±0.131）2）3）6 h　1.89±0.141）2）3）12 h　2.22±0.171）2）3）

表2　心肌中·OH-活性、MDA濃度和SOD活性（n=6，）

表2　心肌中·OH-活性、MDA濃度和SOD活性（n=6，）

注：1）與Norm組及Sham組比較，P＜0.01；2）與CLP組比較，P＜0.01；3）與ED1組比較，P＜0.01

組別OH/（u/mgport）MAD/（nmol/mgport）SOD/（u/mgport）Norm組2.57±0.08 0.22±0.02 6.77±0.38 Sham組3 h 2.85±0.10 0.22±0.03 6.52±0.34 6 h　3.09±0.10　0.24±0.03　6.51±0.37 12 h　3.08±0.11　0.25±0.02　6.49±0.28 CLP組3 h 8.41±0.151）0.62±0.031）3.18±0.211）6 h　10.04±0.161）　0.92±0.041）　2.40±0.221）12 h　9.68±0.151）　0.59±0.041）　3.42±0.261）ED1組3 h 5.93±0.121）2）0.52±0.021）2）4.43±0.271）2）6 h　7.89±0.141）2）　0.70±0.031）2）　4.08±0.291）2）12 h　6.64±0.121）2）　0.54±0.031）2）　4.62±0.291）2）ED2組3 h 5.07±0.101）2）3）0.39±0.021）2）3）5.26±0.251）2）3）6 h　4.32±0.101）2）3）　0.58±0.041）2）3）　4.78±0.231）2）3）12 h　5.82±0.091）2）3）　0.46±0.031）2）3）　5.06±0.231）2）3）

表3　心肌中TNF-α濃度和IL-1β濃度變化（n=6，）

表3　心肌中TNF-α濃度和IL-1β濃度變化（n=6，）

注：1）與Norm組及Sham組比較，P＜0.01；2）與CLP組比較，P＜0.01；3）與ED1組比較，P＜0.01

組別TNF-α/（pg/ml）IL-1β/（pg/m l）Norm組21.02±1.10 4.09±0.17 Sham組3 h 24.70±1.08 4.18±0.17 6 h　25.94±1.15　5.10±0.18 12 h　24.64±1.22　4.82±0.18 CLP組3 h 42.84±1.821）12.33±0.511）6 h　59.03±1.871）　16.41±0.611）12 h　50.86±1.891）　14.64±0.521）ED1組3 h 32.96±1.171）2）10.10±0.451）2）6 h　52.19±1.821）2）　13.99±0.441）2）12 h　45.60±1.721）2）　12.82±0.431）2）ED2組3 h 27.31±1.211）2）3）7.40±0.311）2）3）6 h　48.78±1.451）2）3）　12.10±0.351）2）3）12 h　41.20±1.471）2）3）　10.39±0.331）2）3）

2.4.2心肌組織病理積分CLP組較Sham組明顯升高（P＜0.01）；ED 1組及ED 2組與CLP組比較下降（P＜0.01）；ED 2組較ED 1組明顯下降（P＜0.01）（見表4）。

2.5血清cTn I與心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子的相關(guān)性分析

血清cTnI與心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子的相關(guān)性分析見表5：cTnI與·OH-及MDA呈正相關(guān)，與SOD呈負(fù)相關(guān)；cTn I與TNF-α及IL-1β呈正相關(guān)。

圖1　Sham組心肌病理改變 （HE×400）

圖2　CLP組心肌病理改變 （HE×400）

圖3　ED1組心肌病理改變 （HE×400）

圖4　ED2組心肌病理改變 （HE×400）

表4　心肌組織病理積分 （）

表4　心肌組織病理積分 （）

注：1）與Norm組及Sham組比較，P＜0.01；2）與CLP組比較，P＜0.01；3）與ED1組比較，P＜0.01

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表5　血清cTn I與心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子的相關(guān)性

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥早期即可發(fā)生心肌器質(zhì)性損傷，常伴有心律失常、低血壓和心力衰竭，可進一步加重其他器官損害［7］，防治心肌損傷對改善膿毒癥預(yù)后有重要的臨床意義。

本研究采用CLP法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，RITTIRSCH等［6］認(rèn)為此法建立的膿毒癥動物模型更符合實際的病理生理過程。cTnI是心肌損傷敏感而特異的指標(biāo)，廣泛用于心肌損傷的檢測［8］。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥狀態(tài)下存在氧化應(yīng)激［9］。氧化應(yīng)激指活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多和/或代謝障礙造成其大量堆積，引起細(xì)胞組織的氧化損傷［10］。·OH-是化學(xué)性質(zhì)最活潑的ROS，也是ROS中誘導(dǎo)生物損傷最重要的成分，破壞性極強。然而自由基活性高，性質(zhì)不穩(wěn)定，半衰期短，臨床對其直接測定相當(dāng)困難，通過檢測某些氧化產(chǎn)物含量及抗氧化酶活性可有效評價氧化應(yīng)激狀態(tài)。生物膜中的多不飽和脂肪酸最易受到ROS攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物MDA的含量和性質(zhì)相對穩(wěn)定，檢測方法簡便，一直以來被眾多國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為是反應(yīng)機體氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)。SOD能催化·O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，從而緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)，減少ROS的生成，其活性高低可反應(yīng)機體清除氧自由基的能力。TNF-α及IL-1β是膿毒癥早期導(dǎo)致心肌損傷的主要致炎因子，兩者作用機制相似且相互協(xié)同，同時去除血清中的這兩種成分，可顯著逆轉(zhuǎn)心肌功能障礙［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP組較對照組cTnI、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明顯升高，SOD水平明顯降低（P＜0.01），且cTnI與·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β正相關(guān)，而與SOD負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明氧化應(yīng)激及炎癥因子參與了膿毒癥心肌損傷。

依達拉奉是作用機制明確的氧自由基清除劑，研究發(fā)現(xiàn)其不但可抑制氧化應(yīng)激，還可降低炎癥因子水平［12］，且具有一定程度的劑量依賴性。YAMAZA KI等［13］觀察3種不同濃度（1、10及100μmol）依達拉奉對心肌缺血再灌注損傷的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)10μmol的干預(yù)效果最好。有研究認(rèn)為，臨床使用0.5mg/kg（近似于目前臨床推薦劑量，換算為大鼠劑量約為3mg/kg）的依達拉奉其最大血藥濃度可達到近6μmol［14］。依達拉奉對膿毒癥大鼠心肌損傷進行干預(yù)的最佳劑量尚無報道。在預(yù)實驗中，本實驗用不同劑量（1、3、6、9及12mg/kg）依達拉奉對CLP大鼠進行干預(yù)，檢測血清cTn I同時觀察心肌病理形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示3mg/kg和6mg/kg的干預(yù)效果最為理想，因此本實驗采用這兩個劑量進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種劑量依達拉奉均可降低心肌中·OH-及MDA水平，提高SOD水平，同時可降低心肌中TNF -α及IL-1β水平，減輕心肌損傷，而大劑量組（6 mg/kg）上述指標(biāo)變化更明顯，對膿毒癥心肌損傷的保護作用更明顯。推測機制可能為，膿毒癥狀態(tài)下氧化應(yīng)激一旦觸發(fā)即可級聯(lián)放大生成大量ROS，ROS又可觸發(fā)或加重炎癥反應(yīng)，只有將ROS水平降到一定程度才能遏制這種惡性循環(huán)，而劑量過大又會引起肝、腎損害等毒副作用，加重器官損傷。但本實驗并未行依達拉奉毒副作用的監(jiān)測，尚不能說大劑量依達拉奉可安全應(yīng)用于臨床，而且，因觀察時間較短，也不能說明不同劑量依達拉奉對膿毒癥預(yù)后有影響。

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（張蕾編輯）

Protective effect of edaravone on sepsis-related m yocardial injury in rats

Xue-hua Gao1，Yu-hang Ai2
（1.Departmentof Intensive Care Unit，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou，Gansu，730030，China；2.Department of Intensive Care Unit，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan，410008，China）

Objective To investigate the protective effectof edaravone on sepsis-related myocardial injury in rats. M ethods Seventy eight healthy male Sprauge-Dawley（SD）rats were random ly divided into normal group（Norm），sham operation group（Sham），sepsis group（CLP），low-dose edaravone treated group（ED1）and high-dose edaravone treated group（ED2）.A ratmodel of sepsis-related myocardial injury was developed by cecal ligation and puncture（CLP）.Edaravone was administered to the rats in ED1 and ED2 group.Serum cardiac troponin I（cTn I）was measured，and hydroxyl radicals（OH-），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），tumor necrosis factorα（TNF-α）and interleukin-1β（IL-1β）were examined in the heart tissue at various time points（3 h，6 h，and 12 h after operation）.Myocardial pathomorphology was also observed.Results Changes of all indexes were not significantly different between Norm group and Sham group（P＞0.05）.In ED1 and ED2 group，cTn I，OH-，MDA，TNF-α，and IL-1βwere significantly higher than in Norm and Sham group，but lower than in CLPgroup；SOD was significantly lower than in Norm and Sham group，but higher than in CLP group（P＜0.01）.In ED2 group，cTn I，OH-，MDA，TNF-α，and IL-1βwere significantly lower，but SOD was significantly higher than in ED1 group（P＜0.01）.Myocardial pathomorphology in CLP group included edema，congestion inmesenchyma，and inflammatory cells infiltration were not significantly changed in Norm group and Sham group，but alleviated evidently in ED1 group and ED2 group.Conclusions Edaravone alleviates sepsis-related myocardial injury，which probably related to the inhibition of oxidative stress and cytokines.High-dose edaravone（6mg/kg）ismore efficient than low-dose（3 mg/kg）in protective effecton sepsis-related myocardial injury.

sepsis；myocardial injury；oxidative stress；cytokines；edaravone

中國分類號：R 515.3；R-332A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.002

1005-8982（2016）12-0006-05

2015-10-30