NQO1基因C609T多態性與糖尿病視網膜病變的相關性研究*

鄧燕，徐積兄，殷小龍，易敬林，朱偉鋒

（1.南昌大學第二附屬醫院 兒童眼科，江西 南昌 330006；2.南昌大學第一附屬醫院 內分泌科，江西 南昌 330006；3.南昌大學附屬眼科醫院，江西 南昌 330006；4.南昌大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西 南昌 330006）

論著

NQO1基因C609T多態性與糖尿病視網膜病變的相關性研究*

鄧燕1，徐積兄2，殷小龍1，易敬林3，朱偉鋒4

（1.南昌大學第二附屬醫院 兒童眼科，江西 南昌 330006；2.南昌大學第一附屬醫院 內分泌科，江西 南昌 330006；3.南昌大學附屬眼科醫院，江西 南昌 330006；4.南昌大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西 南昌 330006）

目的研究NQO 1基因C609T多態性與糖尿病視網膜病變之間的關系。方法根據眼底檢查的結果，把546例2型糖尿病患者分成糖尿病視網膜病變組（DR組）和糖尿病無視網膜病變組（NDR組）。采用構象差異凝膠電泳對NQO 1基因C609T多態性進行分型。結果NQO 1基因C609T多態性的CC、CT和TT 3種基因型在DR組的頻率分別為29.7%、53.2%和17.1%，在NDR組的頻率分別為28.1%、51.8%和20.1%，兩組比較差異無統計學意義（c2=0.678，P=0.713）。結論NQO 1基因C609T多態性與我國江西漢族2型糖尿病視網膜病變的發生無關。

糖尿病視網膜病變；依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶；基因多態性

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）作為糖尿病的主要微血管并發癥之一，目前已成為工作年齡人群致盲的主要原因之一［1］。DR發病是一個非常復雜的病理過程，受多種因素影響［2］，其中氧化應激被認為與糖尿病視網膜病變的發生密切相關［3］。依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶 ［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］作為影響氧化應激的重要酶，其活性與外顯子6上的C609T多態性（rs1800566）密切相關。當此位點由C轉變為T時，NQO1蛋白第187位上的脯氨酸轉變為絲氨酸，導致該酶活性明顯降低［4］。本研究采用聚合酶鏈反應-構象差異凝膠電泳［5］（polymerase chain reaction-conformation-difference gel electrophoresis，PCR-CDGE）的方法，對NQO1基因C609T多態性與我國糖尿病視網膜病變的相關性進行了研究，報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2011年6月-2013年3月在南昌大學第一附屬醫院住院546例糖尿病患者。明確診斷為2型糖尿病（均符合1999年WHO糖尿病診斷標準），其中，男性301例，女性245例，年齡30～87歲，平均（59.58±11.24）歲。均為江西地區漢族人，確診糖尿病時年齡≥30歲，且相互之間無血緣關系。根據是否合并糖尿病視網膜病變分成兩組：糖尿病視網膜病變組（DR組）和糖尿病無視網膜病變組（NDR組）。

NDR組滿足以下條件：漢族，年齡≥30歲。散瞳檢眼鏡檢查或小瞳下眼底照相檢查眼底無異常。排除標準：①有其他嚴重全身疾病及急性并發癥；②非2型糖尿病者；③散瞳下檢眼鏡檢查或小瞳下眼底照相眼底不正常（見DR組）。

DR組滿足以下條件：漢族，年齡≥30歲。散瞳檢眼鏡檢查、小瞳下眼底照相檢查或眼底血管熒光造影顯示：微動脈瘤、任一象限中有＞20處視網膜內出血、在2個以上象限有靜脈串珠樣改變、在1個以上象限有顯著的視網膜內微血管異常、新生血管形成玻璃體積血或視網膜前出血。以上檢查出現1項即為存在視網膜病變。排除標準：①有其他嚴重全身疾病及急性并發癥；②非2型糖尿病者。

對入組的研究對象收集臨床資料，包括：性別、年齡、民族、出生地和病程，計算體重指數（body mass index，BMI），測量血壓，包括收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）。測定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、餐后2 h血糖（postprandial two-hour blood glucose，2 hBG）、 糖 化 血 紅 蛋 白 （glycosylated hemoglobin，HbA1c）和血脂，包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）及尿酸（uric acid，UA）等。

1.2基因組DNA提取

使用百泰克全血基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA［6］，根據瓊脂糖凝膠電泳結果，取部分DNA稀釋為大約10 ng/μl作為擴增模板。

1.3NQO1基因C609T多態性分型

用PCR-CDGE的方法對NQO1基因C609T多態性進行檢測。正向引物：5'-GAAGCCCAGACCAA CTTCTG-3'，反向引物：5'-AGGCTGCTTGGAGCAAA ATA-3'，擴增產物長度為247bp。PCR體系為10μl，包含5μl 2×Pfu Master Mix，10μmol正反向引物各0.2μl，模板1.0μl，ddH2O 3.6μl。擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，35個循環；最后72℃延伸5 min。PCR完成后在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行構象差異凝膠電泳分析。

1.4NQO1基因C609T多態性分型的驗證

用PCR-RFLP的方法對NQO1基因C609T多態性的分型進行驗證。PCR體系為10μl，包含5μl 2×Taq Master Mix，10μmol正反向引物各0.2μl，模板1.0μl，ddH2O 3.6μl。擴增條件：94℃預變性3min；94℃變性20s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，35個循環；最后72℃延伸5min。酶切體系為15.5μl，包含其中 10×Buffer R1μl，PCR產物5μl，HinfⅠ0.5μl，ddH2O 9μl。在PCR儀上37℃酶切1 h。用2%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行檢測，酶切產物上樣5μl。當多態性位點為C時，HinfⅠ不能對PCR產物進行酶切，酶切產物仍為247 bp。當多態性位點為T時，247 bp的PCR產物被HinfⅠ切成2個片段：120 bp和127 bp（120 bp和127 bp在2%瓊脂糖凝膠上不能分開，表現為在100 bp和200 bp之間1條帶）。故酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上表現為1個較大條帶（247 bp）的樣本為CC基因型，酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上表現為1個較小條帶（120 bp和127 bp）的樣本為TT基因型，酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上表現為2個條帶的樣本為CT基因型。對55例樣本（約10%）進行酶切。

1.5統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，對于連續型數據，如不符合正態分布，采用中位數和四分位數M（Q25，Q75）表示；符合正態分布且方差齊的數據，兩個樣本均數的比較用兩獨立樣本t檢驗，多個樣本均數的比較用單因素方差分析；不符合正態分布時，兩個樣本的比較用Wilcoxon rank sum test，多個樣本的比較用Kruskal-Wallis H檢驗。Hardy-Weinberg平衡檢驗、基因型頻率分布采用c2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1臨床資料

根據確立的入組標準，共有546例患者滿足以上條件，其中NDR組388例，DR組158例。兩組患者的年齡、性別、BMI、SBP、DBP、2 hBG、HbA1c、TC、TG、HDL-C和LDL-C差異無統計學意義。DR組病程長于NDR組，FBG、Scr、BUN和UA高于NDR組，差異有統計學意義。見表1。

2.2NQO1基因C609T多態性的分型結果

構象差異凝膠電泳顯示NQO1基因C609T多態性表現為3種情況：遷移率快的1條帶、遷移率慢的1條帶和2條帶。見圖1。

圖2為NQO1基因C609T多態性247 bp的PCR產物電泳圖，PCR產物表現為單一清晰的目的條帶，可以用于酶切分型。

酶切結果顯示在構象差異凝膠電泳上顯示為遷移率快的樣本在酶切時都未被切開，為CC基因型，在構象差異凝膠電泳上顯示為遷移率慢的樣本在酶切時都被切開，為TT基因型，而在構象差異凝膠電泳上顯示為2條帶的樣本在酶切時都有2條帶，為CT基因型。見圖3。

2.3Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

從表2可知，NDR組和DR組NQO1基因C609T多態性均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，表明本研究對象具有代表性。

2.4NQO1基因C609T多態性與糖尿病視網膜病變的關系

從表3可知，NQO1基因C609T多態性在NDR組和DR組的基因型頻率差異無統計學意義。

表1　兩組樣本的臨床資料比較

2.5NQO1基因C609T多態性位點與糖尿病患者臨床資料之間的關系

表4顯示NQO1不同基因型的糖尿病患者的臨床資料差異無統計學意義。

圖1　NQO1基因C609T多態性構象差異凝膠電泳

圖2　NQO1基因C609T多態性PCR產物電泳圖

圖3　NQO1基因C609T多態性酶切產物電泳圖

表2　NQO1基因C609T多態性Hardy-Weinberg平衡檢驗　例（%）

表3　NQO1基因C609T多態性位點在NDR組和DR組的基因型頻率　例（%）

表4　NQO 1基因型與臨床資料的關系

續表4

3　討論

近幾十年來，受我國城市化進程明顯加快、人口老齡化和生活方式改變等因素的影響，我國糖尿病患病率顯著增加。最近10年糖尿病流行情況更為嚴重。根據2007～2008年我國14個城市糖尿病流行病學的調查，估計我國20歲以上的成年人糖尿病患病率為9.7%，成人糖尿病總數達9 240萬［7］。我國可能已成為世界上糖尿病患病人數最多的國家。糖尿病視網膜病變作為糖尿病嚴重和常見的微血管并發癥之一，其發生、發展是一個慢性過程，除與血糖控制情況、病程長短、合并全身其他病變、環境因素等有關外，遺傳因素也起了重要作用［8-9］。近期國內外的研究表明有多個多態性位點與糖尿病視網膜病變的發生有關［10-11］。視網膜含有較高的多不飽和脂酸，有較高水平的氧攝入量和糖氧化，易于發生氧化應激。研究表明，糖尿病及其視網膜病變患者存在著嚴重的氧化應激［12］。因此有必要研究氧化應激相關基因多態性與糖尿病視網膜病變之間的關系。

依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶 ［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］是參與氧化應激的重要酶，能催化醌雙電子還原反應，從而減少活性氧的產生［13］。NQO1基因C609T多態性是影響NQO1活性最重要的多態性位點，目前在腫瘤方面的研究較多［14］。有研究認為，NQO1基因C609T多態性與2型糖尿病患者冠心病的發生相關［15-16］，但尚無NQO1基因C609T多態性與糖尿病視網膜病變之間關系的報道。

本研究用快速、簡便、低成本的PCR-CDGE法對546例2型糖尿病患者的NQO1基因C609T多態性進行分型，結果表明NQO1基因C609T多態性各基因型在DR組和NDR組比較差異無統計學意義。進一步分析NQO1基因C609T多態性各基因型與糖尿病患者臨床資料之間的關系，顯示NQO1基因C609T多態性不同基因型糖尿病患者的臨床資料差異無統計學意義。因此，本研究認為，NQO1基因C609T多態性可能與我國江西漢族人群2型糖尿病視網膜病變的發生無關。而文獻中關于NQO1基因C609T多態性與2型糖尿病患者冠心病的發生有關［15-16］，可能是因為NQO1基因C609T多態性在糖尿病大血管病變和微血管病變中所起的作用不同。

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（張蕾編輯）

Association of NQO1 gene polymorphism w ith diabetic retinopathy*

Yan Deng1，Ji-xiong Xu2，Xiao-long Yin1，Jing-lin Yi3，Wei-feng Zhu4
（1.Department of Pediatric Ophthalmology，the Second Affiliated Hospital to Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；2.Department of Endocrinology and Metabolism，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；3.Department of Ophthalmology，Affiliated Eye Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；4.Departmentof Biochemistry and Molecular，Basic Medical College of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

Objective To investigate the association of NQO1 C609T polymorphism with diabetic retinopathy. M ethods Based on the results of direct funduscopy detection，546 patients with type 2 diabetes mellitus were divided into 2 groups:diabetic retinopathy（DR）group and non-diabetic retinopathy（NDR）group.NQO1 C609T polymorphism was genotyped by PCR conformation-difference gel electrophoresis（PCR-CDGE）.Results The frequencies of genotype CC，CT and TT at NQO1 C609T polymorphism in DR group and NDR group were 29.7%，53.2%，17.1%and 28.1%，51.8%，20.1%，respectively.No significant difference in genotype between DR group and NDR group was found（c2=0.678，P=0.713）.Conclusions NQO1 C609T polymorphism may not associated with diabetic retinopathy patientswith type 2 diabetesmellitus in Jiangxi Han nationality.

diabetic retinopathy；NQO1；gene polymorphism

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.008

1005-8982（2016）12-0035-06

2016-01-14

江西省教育廳科學技術研究項目（No：GJJ13165）

朱偉鋒，E-mail：zwf100@163.com