產酒酵母的篩選鑒定及其在小曲中的應用

邊名鴻，萬世旅，代　梅，李小兵

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；3.漢源縣國有皇木林場，四川 雅安 625000）

產酒酵母的篩選鑒定及其在小曲中的應用

邊名鴻1，2，萬世旅1，2，代梅1，李小兵3

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；3.漢源縣國有皇木林場，四川 雅安 625000）

以采自川西南片區(qū)的10種曲樣中分離出的18株酵母為研究對象，以產酒能力為主要指標，通過三級篩選得到一株優(yōu)良產酒酵母Y-18，經分子鑒定確定其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。將其制作成純種的酵母曲并和根霉曲進行復配試飯。結果表明，酵母Y-18在大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛孔畹停凭茸罡撸謩e為0.69 g/100 mL和10.3%vol；在60 g蒸熟大米中，添加酵母曲1.8 g、根霉曲0.5 g時，試飯酒精度最高（7.24%vol）、酸度適中、糖分最低。

產酒酵母；篩選；鑒定；小曲；應用

小曲酒是中國白酒的主要酒種之一，傳統(tǒng)小曲酒是以小曲作為糖化劑和發(fā)酵劑，以高粱、大米、玉米、小麥等為原料釀造而成，具有一種清雅的香氣和醇甜的口感。小曲白酒的生產，由于具有設備簡單，投資少、點多面廣、操作簡便、發(fā)酵期短、出酒率高、用曲量少、原料廣泛、適于地產地銷等特點而深受釀酒廠家和廣大消費者喜愛［1-2］。

川法小曲酒的研究主要集中在提高其產酒率和風味上，因此優(yōu)良菌種的篩選及應用至關重要。李銳利［3］從收集到的小曲酒酒曲中分離篩選出一株產乙酸乙酯性能較高的酵母菌株BY2，在優(yōu)化產酯條件下BY2的產酯量為4.812 g/L，較優(yōu)化之前的方案產酯量提高了37.5%；鄧開野等［4］從甜酒曲中經分離、誘變、篩選后得到1株高糖化力的根霉菌株，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，糖化力達到1 317 mg/（h·g），具有一定應用價值；張翠英等［5］通過添加低產高級醇菌株進行小曲酒半固態(tài)發(fā)酵，小曲酒酒精度、殘?zhí)恰⒖偹岷涂傰セ緹o影響，但卻使高級醇含量大幅度下降，與純小曲發(fā)酵相比降低了37.2%。從發(fā)酵基質和自然界中直接篩選培育耐高濃度酒精的酵母菌，是目前獲取高產酒精酵母的一種既經濟又實用的方法［6］，這些酵母菌在人工生產中經過不斷馴化，在高產、耐高濃度酒精及遺傳性能方面比較穩(wěn)定。本研究從曲樣中篩選適應力較強、發(fā)酵力強、產酒性能良好的酵母，為后續(xù)應用于小曲白酒生產的研究奠定基礎，對提高原料的出酒率和成品酒的質量穩(wěn)定性也有一定的積極作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及主要試劑

成都、瀘州等地的10種不同曲樣中分離出的18株酵母，編號Y-1～Y-18。試飯對比小曲為市售酒曲。3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基［7］，TTC下層培養(yǎng)基［7］；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）培養(yǎng)基［8］；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基；20°Bx大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基［9］；20°Bx高粱發(fā)酵培養(yǎng)［9］。

1.2儀器與設備

MYT型糖度儀：上海滬粵明科技儀器有限公司；Super Alcomat型酒精度測定儀：北京桑翌實驗儀器研究所；UV-200型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯有限公司；LHR型智能生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學儀器有限公司；BS-2F型數(shù)控恒溫搖床培養(yǎng)箱：常州精成國華儀器有限公司；MLS-3020型全自動高壓滅菌鍋：日本三洋公司。

1.3試驗方法

1.3.1產酒酵母的初篩

將從6種曲樣中分離純化的酵母菌株接種至TTC下層培養(yǎng)基上，30℃條件下倒置培養(yǎng)48 h后倒入TTC上層培養(yǎng)基，保溫2 h觀察菌落顏色深淺。

1.3.2產酒酵母的復篩

將經TTC初篩獲得的酵母菌接種到YEPD培養(yǎng)基中30℃、110 r/min培養(yǎng)24 h。取活化菌液計數(shù)調整菌懸液中酵母細胞數(shù)為108CFU/mL，按10%的接種量分別接種于高粱發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃靜置發(fā)酵。每隔12 h振蕩稱質量并記錄CO2失重，直到12 h的CO2失重＜0.2 g時停止發(fā)酵，每株菌設計3個平行對照組，篩選出最適發(fā)酵培養(yǎng)基和CO2失重較好的產酒酵母進行三級篩選。

1.3.3產酒酵母的三級篩選

將復篩獲得的產酒酵母接種到YEPD培養(yǎng)基中110 r/min、30℃培養(yǎng)24 h，取活化菌液計調整菌懸液中酵母細胞數(shù)為108CFU/mL，10%的接種量接種至1.3.2中篩選出的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下靜置發(fā)酵84 h，發(fā)酵結束后采用DNS法測定樣液中的殘?zhí)牵?0-11］，比重法測定100 mL蒸餾樣液中的酒精度，每株菌設計3個平行對照組。

1.3.4產酒酵母的鑒定

將篩得的酵母送往上海杰李生物技術有限公司進行鑒定。

1.3.5酵母曲與根霉曲的復配試飯

將篩選出的優(yōu)良產酒酵母制作成純種酵母曲［12］，并和根霉曲進行復配，復配方案如表1所示。將復配好的曲接入60 g蒸熟的大米中，于30℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出，用DNS法測定其試飯?zhí)欠郑味ǚy定酸度［13］，比重法測定蒸餾液的酒精度，每組做3個平行，并與市售小曲進行對比。

表1　酵母曲與根霉曲復配方案Table 1 The compound plans of yeastQuandRhizopus Qu

2　結果與分析

2.1產酒酵母的初篩

TTC可與酵母的代謝產物產生顯色反應，酵母的產酒精能力越強則與TTC反應后菌落的呈色越深，利用TTC培養(yǎng)基對18株酵母進行初篩，顯色結果如圖1所示。由圖1可知，顏色較深（較紅）的7株酵母菌株編號分別為Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18，將經過TTC平板篩選得到的酵母做進一步復篩。

圖1　TTC與酵母顯色結果Fig.1 The chromogenic results of TTC and yeast

2.2產酒酵母的復篩

發(fā)酵周期和發(fā)酵速度是考察釀酒酵母發(fā)酵性能的重要指標，酵母菌利用可發(fā)酵性糖，生成乙醇和二氧化碳，因此可利用發(fā)酵過程中發(fā)酵液減少的二氧化碳量來衡量酵母的發(fā)酵性能［14］。將7株菌Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18制成菌懸液，稀釋至細胞數(shù)為108CFU/mL，按10%的量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，每株菌設計3個平行對照組，每12 h觀察產氣情況及質量變化情況，結果見圖2。

由圖2可知，篩選菌種在相同條件下經84 h發(fā)酵后，大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基的CO2失重整體高于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和高粱發(fā)酵培養(yǎng)基；在3種發(fā)酵培養(yǎng)基中，7株酵母起酵速度都比較快，其中Y-16、Y-17和Y-18的累積CO2失重都在較高水平，最高在9.95～10.77 g，發(fā)酵速度上也優(yōu)于其他菌，各項指標都較為穩(wěn)定，隨培養(yǎng)基的變化波動較小。綜合以上分析，Y-16、Y-17和Y-18的發(fā)酵性能較好且相對穩(wěn)定，故選用菌株Y-16、Y-17和Y-18進行三級篩選。

圖2　產酒酵母復篩CO2失重結果Fig.2 CO2weight loss results ofBaijiu-making yeast in the secondary screening

2.3產酒酵母的三級篩選

將Y-16、Y-17、Y-18三株菌接種于大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置發(fā)酵84 h檢測其酒精度與殘?zhí)侵笜耍Y果如圖3所示。

圖3　產酒酵母三級篩選的殘?zhí)羌熬凭缺容^Fig.3 Comparison of residual sugar and alcohol content of the Baijiu-making yeast tertiary screening

酵母發(fā)酵消耗糖生成酒精，殘?zhí)橇吭降蛣t酒精度越高。由圖3可知，3株菌的發(fā)酵性能良好，經過84 h發(fā)酵后酒精度均＞8.8%vol，殘?zhí)橇烤冢?.8 g/100 mL；菌株Y-18在糖度為20°Bx的發(fā)酵液中有較好的發(fā)酵特性，殘?zhí)橇枯^菌株Y-16和菌株Y-17低，還原糖利用率高，發(fā)酵比較徹底，產酒精能力也相對于其他兩株菌較強，其殘?zhí)橇亢途凭确謩e為0.69 g/100 mL和10.3%vol。

2.4產酒酵母的鑒定［15］

利用ITS1和ITS4一對引物對菌株Y-18的rDNA-ITS序列進行PCR擴增，并對擴增序列測序，用BLAST將測序結果與GenBank數(shù)據庫中的序列進行比較并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4。由圖4可知，Y-18與Saccharomyces cerevisiae SCPW 17聚在一簇的相似度為100%，表明其很可能屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的一個種。

圖4　菌株Y-18的rDNA-ITS序列與其他近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y-18's rDNA-ITS sequence and other relative species

2.5純種酵母與根霉的復配曲試飯試驗

試飯試驗是檢驗小曲質量的有效方法，通過分析試飯后蒸餾液的酸度、酒精度及殘?zhí)强梢栽谝欢ǔ潭壬戏磻鲂∏趯嶋H生產中的情況。本試驗利用菌株Y-18的純種曲與實驗室篩選的一株優(yōu)良根霉制作的根霉曲進行復配，并與市售小曲進行試飯試驗對比，其結果如圖5所示。

圖5　不同復配方案的試飯結果Fig.5 The rice-testing results of different compound plans

由圖5可知，酵母菌和根霉在生長上存在一定的相互影響；根霉曲的量多有利于前期的糖化過程，使得曲的糖化力增強，可為酵母發(fā)酵產酒提供更多的糖，酵母曲有利于后期的產酒，隨著酵母曲量的增加試飯的酒精度也隨之升高，酸度也有一定增加；在所考察的復配方案中，A10的試飯?zhí)欠肿畹汀⑺岫冗m中、酒精度最高，其酒精度為7.24%vol。而對比市售小曲酒精度為2.34%vol，還原糖的含量比較高，說明對比小曲的發(fā)酵速度明顯慢于實驗組。因此就48 h內復配曲試飯的整體效果來看，試驗組要好于對比市售小曲，該試驗組菌種配比可作為小曲制作的參考配比。

3　結論

經TTC顯色試驗、產氣實驗、和發(fā)酵實驗，從18株酵母中篩選出一株優(yōu)良的產酒酵母Y-18，其菌落與TTC顯色后呈深紅，在大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵84 h后的CO2失重為10.77 g、酒精度為10.3%vol、殘?zhí)菫?.69 g/100 mL，經分子鑒定確定其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），將該菌株制作成純種的酵母曲并和根霉曲進行復配研究，試飯結果表明，復配方案A10的試飯效果最佳，其糖度為4.63%、酸度為9.5 g/100 mL、酒精度為7.24%vol，可作為利用該菌株生產小曲的參考依據，因此，酵母菌Y-18作為生產小曲的菌種具有較好的應用價值。

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Screening and identification ofBaijiu（liquor）-making yeast and its application in Xiaoqu

BIAN Minghong1，2，WAN Shilv1，2，DAI Mei1，LI Xiaobing3
（1.School of Biotechnology Engineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China；2.Sichuan University of Science&Engineering，Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Zigong 643000，China；3.State-owned Huangmu Forest Farm of Hanyuan，Ya'an 625000，China）

Using 18 strains yeast separated from 10 kinds ofBaijiu（liquor）starter samples of Sichuan southwest area as research object and using alcohol-producing ability as main indicator，a dominate strain，Baijiu-making yeast Y-18 was obtained by tertiary screening，and it was identified asSaccharomyces cerevisiaeby molecular identification.The yeast was made into purebred yeastQuand mixed withRhizopus Quto carry out the rice-testing experiments.The results indicated that in rice fermentation medium，the residual sugar content of yeast Y-18 was the lowest（0.69 g/100 ml）and the alcohol content was the highest（10.3%vol）.When the yeastQuaddition was 1.8 g andRhizopus Quaddition was 0.5 g in the 60 g steamed rice，the rice-testing had the highest alcohol content（7.24%vol），moderate acidity and the lowest residual sugar.

Baijiu（liquor）-making yeast；screening；identification；Xiaoqu；application

TS261.11

0254-5071（2016）03-0057-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.013

2015-12-15

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開發(fā)基金項目（NJ2013-03）

邊名鴻（1979-），女，副教授，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。