日內瓦毛霉對妊娠烯醇酮的生物轉化研究

孫工兵（黑龍江金九藥業股份有限公司，黑龍江 密山 158306）

·論著·

日內瓦毛霉對妊娠烯醇酮的生物轉化研究

孫工兵
（黑龍江金九藥業股份有限公司，黑龍江 密山 158306）

目的探索日內瓦毛霉微生物對妊娠烯醇酮的生物轉化問題。方法將妊娠烯醇酮經生物轉化后，發生7-羥基化，得到兩種產物，通過紅外、核磁、質譜分析，確定其化學結構進行優化研究。結果碳源、氮源對轉化率的影響很大，試驗最佳的碳源、氮源確定為葡萄糖和蛋白胨，輔助氮源為酵母膏。結論通過單因素條件優化，確定碳源和氮源加量分別為3.6%和1.3%。對不同濃度無機鹽KH2PO4對轉化率的影響，確定其濃度為0.16%，初始pH為4.5時，最終得到主產物的轉化率為59.2%。

甾體；妊娠烯醇酮；日內瓦毛霉；羥基化

在臨床應用上，甾體激素是一類重要的激素藥物，廣泛的應用歸因其生理活性［1］，這種作用活性于C11上的羥基化作用關系密切。

20世紀50年代美國普強藥廠利用微生物黑根霉的羥化酶將黃體酮一步轉化成11α-羥基黃體酮［2］，即對甾體化合物結構的改造，這一方法成功地解決了皮質激素合成中的最大難題，使微生物轉化技術成為甾體藥物不可缺少的關鍵技術。先令公司開發成功的口服避孕藥Yasmin（屈螺酮加炔雌醇），在美國和歐洲早已上市，7a，15α-二羥基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中間體，直接轉化方法簡單，副產物少［3］。研究表明，去氫表雄酮（DHEA）的7-羥基衍生物對治療癌癥和阿爾茨海默病有重要療效，同時它還具有抗糖皮質激素作用、增強機體免疫功能和促進減肥功效［4］。

本研究選擇日內瓦毛霉對妊娠烯醇酮生物轉化的研究，對轉化條件進行了優化的同時，獲得了具有超強生物活性潛力的7-羥基甾體衍生物。7-羥基甾體衍生物的產率得到了進一步的提高，為新藥的開發和設計奠定了良好的基礎。

1　材料

1.1菌種：日內瓦毛霉（M.genevensis），自篩，經中國微生物菌種保藏管理委員會，農業微生物中心（ACCC）鑒定為日內瓦毛霉。

1.2培養基：分離培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，少量甾體；酵母膏培養液：蛋白胨12 g/L，葡萄糖40 g/L，磷酸二氫鉀1.3 g/L，酵母膏1 g/L，用1 mol/L HCl調pH為4.5；斜面培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH為4.5。

2　方法

2.1薄層層析（TLC）：稱取27 g硅膠G置具塞三角瓶中，加3 g石蠟和50 mL三氯甲烷，制備成0.25 mm厚的硅膠薄層層析板（75 mm×25 mm）；濃硫酸∶甲醇=1∶1為顯色劑；丙酮∶石油醚=1∶3（V/V）作展開劑。樣品用上行法展開，將層析板浸于顯色液中取出，用電吹風機吹干，吹干后用顯色劑噴霧，放在電熱板上加熱顯色。

2.2菌種分離篩選：標本采集：在選好適當地點后，取1 g土壤置于已滅菌的試管中，加10 mL無菌水，漩渦振蕩器振蕩搖勻，靜置，取上清液，滴于培養基中，再用玻璃棒涂勻。置27℃恒溫培養箱中培養1～5 d后，從分離培養基中挑出單菌落，在相同條件下繼續培養1～5 d后，將純化的菌株移置到斜面培養基上，編號保存。將甾體底物進行發酵培養，用薄層層析技術檢測，選出具有轉化甾體能力的優良菌株。將初篩后得到的菌株再次進行甾體轉化試驗，復篩出轉化甾體效果更好的菌株。

2.3甾體轉化試驗：取1支斜面菌種，用接種針將菌種加入已滅菌的裝有發酵液100mL的錐形瓶中。27℃，220 r/min振蕩培養2 d，將1.5 g妊娠烯醇酮溶于30 mL丙酮中，在每瓶已生長的菌液中加入2 mL丙酮溶液，相同條件下繼續發酵培養4 d。

2.4甾體轉化產物的分離與分析：用乙酸乙酯將發酵液和菌絲體，減壓蒸餾萃取6次后，合并有機相，真空旋轉蒸發儀蒸去溶劑，真空干燥，柱層析分離，得到產物粗品后，以MS、IR和2D-NMR波譜技術鑒定結構。

3　結果

3.1菌種的分離與篩選：細菌、放線菌和真菌均具有甾體羥基化作用的微生物，我們用從土壤中篩選出的菌種進行發酵試驗，篩選時選用妊娠烯醇酮作為底物，最終獲得了轉化能力強、效果較好的菌株日內瓦毛霉。

3.2甾體生物轉化產物的分離：在用硅膠柱層析技術分離產物時，曾經選用了丙酮-石油醚、丙酮-二氯甲烷、丙酮-氯仿、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-甲醇等體系進行試驗。結果發現，在妊娠烯醇酮（1）的生物轉化中，以丙酮∶石油醚（1∶3）作展開劑，可以成功地將混合物分開，效果良好。

3.3日內瓦毛霉對妊娠烯醇酮的轉化：妊娠烯醇酮在用Mucor genevensis進行生物轉化時，生成7α，11α-二羥基妊娠烯醇酮2和7α，11β-二羥基妊娠烯醇酮3。通過紅外、質譜分析、核磁等方法，確定其化學結構分別是7α和11α-二羥基妊娠烯醇酮2，7α和11β-二羥基妊娠烯醇酮3，詳見表1。

表1　硅膠柱層析技術分離產物的理化常數結

3.4日內瓦毛霉培養基組成的優化

3.4.1不同葡萄糖濃度對轉化率的影響：試驗結果表明，當葡萄糖濃度為3.5%時，轉化率最高，詳見表2。

表2　葡萄糖濃度對轉化率的影響（%）

3.4.2不同氮源對轉化率的影響：試驗結果表明，用酵母膏為氮源，轉化率為最高。但由于酵母膏和蛋白胨各有優缺點：酵母膏成分復雜、價格較貴、稱重時難控制，蛋白胨價格相對便宜、稱重時易控制，因此該試驗以蛋白胨為主要氮源，酵母膏為輔助氮源，詳見表3。

表3　不同氮源對轉化率的影響（%）

3.4.3蛋白胨濃度對轉化率的影響：結果表明，當蛋白胨濃度1.4%時，轉化率最大，詳見表4。

表4　蛋白胨濃度對轉化率的影響（%）

3.4.4KH2PO4濃度對轉化率的影響：研究結果表明，當KH2PO4濃度為0.16%時，轉化率最大，詳見表5。

表5　KH2PO4濃度對轉化率的影響（%）

3.4.5培養基初始pH對轉化率的影響：培養基的初始pH影響產物的轉化。因此，羥基化酶反應體系的pH以4.5效果最好，詳見表6。

表6　初始pH對轉化率的影響（%）

4　討論

從土樣中篩選到1株能轉化甾體的菌株，經鑒定為日內瓦毛霉菌株。本文研究日內瓦毛霉對妊娠烯醇酮的生物轉化方面進行了研究。通過利用紅外和二維核磁波譜技術，確定日內瓦毛霉化學結構為7α，11α-二羥基妊娠烯醇酮和7α，11β-二羥基妊娠烯醇酮。日內瓦毛霉對妊娠烯醇酮的羥基化反應發生在C-7位上，并具有位置專一性。

同時對培養基組成進行優化研究。研究了不同碳源、氮源對妊娠烯醇酮的轉化率的影響，確定葡萄糖和蛋白胨為試驗最佳碳源和氮源，酵母膏為輔助氮源，單因素試驗確定其含量分別為3.5%和1.4%；研究了無機鹽KH2PO4不同濃度對轉化率的影響，確定其濃度分別為0.16%，初始pH為4.5時，最終得到主產物轉化率是：59.2%。日內瓦毛霉能夠專一性地對妊娠烯醇酮經行羥基化反應，這為研究妊娠烯醇酮藥物開發及體內代謝研究提供一定的理論依據。

［1］楊燦宇，杜連祥.甾體C11α-羥化菌株AF9612發酵條件的研究［J］.天津輕工業學院學報，1999，23（2）：45-48.

［2］Wang J，Chen CZ，Li BA，et al.Enzyme Microb Technol ［J］.1998，22（3）：368-373.

［3］尚珂，胡海峰，朱寶泉.微生物轉化法合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮［J］.中國醫學生物技術應用，2004，33 （2）：30-34.

［4］Phelan A，Elliott C，O'Hare P.Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22［J］.Nat Biotechnol，1998，16（4）：440-443.

Bio-Transformation of Pregnenolone by Mucor Genevensis

Sun Gongbing
（Heilongjiang Jinjiu Pharmaceutical Company Limited，Mishan 158300，China）

Microbial transformation of pregnenolone was studied in the Mucor genevensis culture，in which 7α，11α-dihydroxypregnenolone and 7α，11 β-dihy droxypregnenolone were given from the metabolites.The biotransformation products were determined by IR，NMR and MS analysis.The results showed that the optimal condition for the biosynthesis of 7α，11α—dihydr-roxypregnenolone was as follows：3.5%dextrose，1.4%peptone，0.16%potassium dihydydrogen phosphate，initial pH 4.5.The yield of 7α，11α-dihydroxypregnenolone was 59.2%.

Steroids；Biotransformation；Pregnenolone；Hydroxylation

R917

A學科分類代碼：31047

1001-8131（2016）04-0401-03

黑龍江省農墾總局基金資助（HNK12KF-24）；大慶科技局科研項目（szd201126）

2016-03-01