脈血康膠囊對UUO大鼠腎組織STAT3和α-SMA表達的動態(tài)研究*

郭慶喜，蒲　霞，陳凱鋒，楊成萬，曹　靈，孫興旺△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；2.中國人民解放軍42醫(yī)院病理科，四川樂山 614100；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000)

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脈血康膠囊對UUO大鼠腎組織STAT3和α-SMA表達的動態(tài)研究*

郭慶喜1，蒲霞1，陳凱鋒2，楊成萬1，曹靈3，孫興旺1△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；2.中國人民解放軍42醫(yī)院病理科，四川樂山 614100；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000)

目的動態(tài)觀察脈血康膠囊對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎組織信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達的影響，探討脈血康膠囊對防治腎臟間質(zhì)纖維化的可能機制。方法將96只SD雄性大鼠隨機分為健康對照組、假手術(shù)組、模型對照組及脈血康組4個組，各24只，前3組給予生理鹽水灌胃，脈血康治療組術(shù)前3天開始給予脈血康溶液灌胃。于造模后第1、4、7、14天每組隨機處死6只大鼠，動態(tài)觀測腎組織形態(tài)學變化、纖維化情況及腎組織STAT3、α-SMA的表達。結(jié)果隨梗阻時間延長，模型對照組及脈血康組腎小管上皮變性、萎縮，腎小管擴張，腎間質(zhì)增寬，以模型對照組最明顯。模型對照組和脈血康組腎小管上皮STAT3、α-SMA表達逐漸增高，與健康對照組及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，脈血康組與模型對照組相比較，STAT3、α-SMA表達減少(P<0.05)。結(jié)論脈血康膠囊可能是通過Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號通路調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，延緩UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化進程。

脈血康膠囊；腎間質(zhì)纖維化；上皮細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化；信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子-3；α-平滑肌肌動蛋白

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各種慢性腎病進展到終末期的共同歸路，它是衡量慢性腎臟疾病進展的重要病理指標[1]。因而阻止或延緩小管間質(zhì)纖維化是阻止或逆轉(zhuǎn)進行性腎功能惡化的關(guān)鍵。目前認為RIF形成涉及細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等多種因素，最終結(jié)局是大量ECM 的過度積聚[2]。腎間質(zhì)肌成纖維細胞(myofibroblast,MFB)是ECM產(chǎn)生的主要細胞[3]，腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation,EMT)是MFB主要來源之一[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)脈血康膠囊對慢性腎衰竭具有較好的療效[5]。本研究構(gòu)建大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型，檢測腎組織α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT-3) 的表達，探討脈血康膠囊對UUO大鼠RIF的防治作用及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1動物及試劑普通級雄性SD大鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2008-1-7，使用許可證號：SYXK(川)2008-065，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供。所有大鼠飼養(yǎng)于專用的動物房，每籠1只，并保持恒溫、通風、安靜，每日更換墊料，定期消毒。脈血康膠囊購于重慶時珍閣普生藥業(yè)有限公司(國藥準字Z10970056)。兔抗鼠STAT3多克隆抗體、兔抗鼠α-SMA多克隆抗體購于北京博奧森生物公司，多聚賴氨酸購于深圳晶美公司，免疫組織化學即用型SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購于福州邁新生物公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立及分組大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分成4組：健康對照組24只，假手術(shù)組24只，模型對照組24只，脈血康組24只。模型對照組和脈血康組造模方法：實驗大鼠用2%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射，待麻醉效果滿意后，將大鼠固定于動物手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)剪毛，常規(guī)消毒、鋪巾，行下腹正中切口，在膀胱頸處分離出右側(cè)輸尿管，4號絲線結(jié)扎2次，制作大鼠UUO模型[6]。假手術(shù)組只做右側(cè)輸尿管游離但不結(jié)扎，健康對照組不做手術(shù)。健康對照組、假手術(shù)組及模型對照組于術(shù)前3 d起每日2 mL氯化鈉溶液灌胃。脈血康組手術(shù)前3 d及手術(shù)后每日給予脈血康0.05 g/kg，以2 mL 氯化鈉溶液稀釋灌胃。

1.2.2標本采集分別于第1、4、7、14天各組隨機選取6只大鼠，用2%戊巴比妥0.5 mL腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺，暴露心臟及雙腎，用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定腎組織，以沿腎周剝離腎包膜后，取右側(cè)腎臟對剖后置于4%多聚甲醛固定液中固定。

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)形態(tài)觀察及結(jié)果評定腎組織經(jīng)脫水、透明、浸臘、包埋制成組織臘塊，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡形態(tài)學觀察，每張切片隨機選擇10個400倍視野，觀察腎小管-間質(zhì)的病理變化。腎小管-間質(zhì)病變由3個參數(shù)判定：腎小管上皮細胞變性、壞死及小管擴張程度；炎性細胞的浸潤程度；小管間質(zhì)纖維化的程度。每個參數(shù)按0～3分評定(0分判為正常；1分判為輕度受損，病變范圍小于15%；2分判為中度受損，病變范圍15%～50%；3分判為重度受損，病變范圍超過50%)，計算其均值，作為該例腎小管-間質(zhì)損傷指數(shù)[6]。

1.2.4免疫組織化學及結(jié)果評定常規(guī)切片，厚度3 μm，烤干備用。免疫組織化學采用SABC法，按照試劑盒說明行STAT3、α-SMA免疫組織化學染色。同時以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。采用Image-pro plus病理彩色圖像分析處理系統(tǒng)進行分析，通過光學顯微鏡攝取圖像，對圖像進行灰度轉(zhuǎn)換，使陽性面積與背景分開，進行自動測量。每例切片隨機觀察20個不重疊的400倍視野，計算陽性表達部位染色面積總和與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎血管、腎小球及腎小管管腔面積)，以兩者比值的平均值進行比較[7]。

2　結(jié)　　果

2.1腎組織形態(tài)學改變健康對照組、假手術(shù)組術(shù)后各時間點腎臟大小、形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)清楚。模型對照組術(shù)后第4天開始腎體積增大，腎小管上皮腫脹，腎間質(zhì)疏松水腫，部分腎小管上皮細胞變性壞死，腎小管擴張，腎小管間隙增寬，纖維組織增生伴炎性細胞浸潤。脈血康組術(shù)后第7天開始出現(xiàn)早期纖維化的病理改變，腎小管損傷、間質(zhì)纖維化程度較模型對照組輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

2.2腎小管上皮α-SMA動態(tài)表達健康對照組及假手術(shù)組大鼠腎小管上皮幾乎不表達α-SMA。模型對照組及脈血康組各時間點腎小管上皮細胞見α-SMA表達，與前兩組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且隨梗阻時間的延長表達呈逐漸上升趨勢。與模型對照組比較，脈血康組α-SMA表達減少，第14天差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)，見圖2、表2。

2.3腎小管上皮STAT3動態(tài)表達STAT3在健康對照組及假手術(shù)組表達極少，模型對照組及脈血康組各時間點表達均較前兩組強(P<0.01)，且隨梗阻時間的延長表達逐漸上升；與模型對照組相比，脈血康組STAT3于第4、7、14天降低明顯(P<0.05)，見圖3、表3。

A:健康對照組；B:模型對照組；C:脈血康組。

圖1　　各組大鼠第14天腎組織形態(tài)學觀察(HE×200)

a：P<0.01，與健康對照組比較；b：P<0.01，與假手術(shù)組相比較；c：P<0.05，與模型對照組相比較。

A:健康對照組；B:模型對照組；C:脈血康組。

圖2　　各組大鼠腎第14天小管上皮α-SMA的表達(SABC×200)

a：P<0.01，與健康對照組比較；b：P<0.01，與假手術(shù)組比較；c：P<0.05，與模型對照組比較。

A:健康對照組；B:模型對照組；C:脈血康組。

圖3　　各組大鼠第14天腎小管上皮STAT3的表達(SABC×200)

a：P<0.01，與健康對照組比較；b：P<0.01，與假手術(shù)組比較；c：P<0.05，與模型對照組比較。

3　討　　論

脈血康膠囊主要成分是含有生物活性的水蛭素，水蛭素是存在于水蛭唾液中的一種酸性多肽類物質(zhì)，具有抗凝與抗血栓形成，降低血壓和血脂，改善血流動力學和微循環(huán)等作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，脈血康膠囊可以改善腎臟血液循環(huán)，減少蛋白尿?qū)δI臟起到保護的作用[9]。臨床應用脈血康膠囊聯(lián)合愛西特治療慢性腎衰竭患者具有一定的療效，但作用機制不清楚，本研究通過預實驗選定最佳劑量脈血康膠囊治療UUO模型大鼠，研究脈血康膠囊延緩腎間質(zhì)纖維化的可能機制。

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病發(fā)展到慢性腎衰竭的共同病理特征，多種調(diào)節(jié)因子通過多種途徑最終引起細胞外基質(zhì)過多沉積及成纖維細胞過度增生。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT 信號通路廣泛參與細胞的活化、增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過程[10-12]。在JAK/STAT信號途徑中，STAT3是JAKs的下游底物[13]，其作用非常廣泛，介導多種細胞因子和生長因子的信號向細胞核傳導，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞功能。研究發(fā)現(xiàn)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制中，多種因子可通過激活JAK/STAT信號途徑發(fā)揮作用[14]，JAK/STAT通路的激活可促使腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，上調(diào)Ⅰ型膠原的表達，促進纖維連接蛋白的合成，增加促纖維化因子的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)及結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達，從而促進腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展[15]。Nightingale等[16]發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素M(OSM)可以通過STAT1、STAT3的磷酸化而激活JAK/STAT通路，從而促使腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化。α-SMA是腎間質(zhì)纖維化肌成纖維細胞的一種特異性標志蛋白，是腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)的標志。

本實驗在UUO大鼠模型中觀察到隨著梗阻時間延長，模型對照組大鼠腎臟出現(xiàn)體積逐漸增大，腎小管上皮變性、萎縮，腎小管擴張，腎間質(zhì)增寬，纖維組織增生伴炎細胞浸潤等表現(xiàn)，脈血康組術(shù)后第7天開始出現(xiàn)早期纖維化的病理改變，但腎小管損傷、間質(zhì)纖維化程度較模型對照組輕(P<0.05)。免疫組織化學結(jié)果顯示較健康對照組及假手術(shù)組，模型對照組及脈血康組術(shù)后各時間點α-SMA表達增加明顯(P<0.01)，且隨梗阻時間延長，表達增高。與模型對照組相比，脈血康組α-SMA表達減少，第14天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明UUO可以成功建立腎間質(zhì)纖維化模型，導致腎小管上皮發(fā)生EMT，而脈血康膠囊可以調(diào)節(jié)腎小管EMT，減輕腎間質(zhì)纖維化程度。同時實驗觀察到，JAK/STAT 信號通路因子STAT3在模型對照組及脈血康組各時間點表達均較健康對照組及假手術(shù)組明顯增高(P<0.01)，且隨梗阻時間的延長表達逐漸上升。運用脈血康治療后，STAT3表達減少，第4天開始減少明顯(P<0.05)。由此可見，脈血康能降低STAT3的表達，調(diào)節(jié)腎小管上皮EMT，從而減少肌成纖維細胞生成及ECM的堆積，延緩腎間質(zhì)纖維化進程。

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Dynamic observation of Maixuekang capsule on the expression of STAT3 and α-SMA in rats with unilateral ureteral obstruction*

GuoQingxi1,PuXia1,ChenKaifeng2,YangChengwan1,CaoLing3,SunXingwang1△

(1.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.DepartmentofPathology,No.42HospitalofPeople′sLiberationArmy,Leshan,Sichuan614100,China; 3.DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan,646000,China)

ObjectiveTo study the effect of Maixuekang capsule on the expression of signal transducer and activator of transcription-3(STAT-3) and α-smooth muscle actin(α-SMA) in the occlusion kidney dynamically by unilateral ureteral obstruction(UUO) in rats,and to investigate the effect and the mechanism of Maixuekang capsule on the renal interstitial fibrosis(RIF).MethodsNinety-six male sprague dawley(SD) rats were randomly divided into normal control group,sham-surgery group,model control group and Maixuekang group,with 24 rats in each group.The rats were given Maixuekang by gavage once a day started 3 days prior to operation,normal control group,sham-surgery group and model control group were given normal saline (NS)．Rats were sacrificed at the 1th，4th，7th and 14th day after operation．The levels of expression of STAT3、α-SMA and renal histopathology at each time point were examined in each group．ResultsIt′s significance of renal change including renal tubular epithelial degeneration and atrophy,renal tubular expansion and renal interstitial thickening of wide in model control group and Maixuekang group with the extension of obstruction time,especially in model control group.The expressions of STAT3 and α-SMA were increased in model control group and Maixuekang group,compared with normal control group and sam-surgery group(P<0.01).Compared with model control group,the expressions of STAT3 and α-SMA in Maixuekang group were decreased(P<0.05).ConclusionMaixuekang capsule may regulate the epithelial-myofiberoblast transdifferentiation of renal tubular epithelium through the JAK/STAT signaling pathway to postpone the proceeding of RIF.

Maixuekang capsule;renal interstitial fibrosis;epithelial-myofibroblast transdifferentiation;signal transducer and activator of transcription-3;α-smooth muscle actin

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.004

四川省科技廳重點項目(2010JY0080);四川省教育廳一般項目(11ZB226)。作者簡介：郭慶喜(1977-)，碩士，副教授，主要從事分子病理方面的研究?！?/p>

，Tel：13508035625；E-mail：lzsunxw@163.com。

R692.3+3；R285.5

A

1671-8348(2016)24-3323-04

2016-02-04

2016-06-28)