巴西蜂膠對HepG2細胞增殖抑制活性研究

李赫宇，趙玲（.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457；.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢43003）

巴西蜂膠對HepG2細胞增殖抑制活性研究

李赫宇1，趙玲2
（1.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

巴西蜂膠具有豐富而顯著的生理活性，采用MTT法對巴西蜂膠提取物進行了HepG2細胞增殖抑制活性的研究，發現巴西蜂膠對HepG2細胞增殖具有良好的抑制活性，且呈顯著的量效關系和時效關系，即劑量越大、藥物作用時間越長，則對HepG2細胞的抑制率越高。

巴西蜂膠；HepG2細胞；增殖抑制活性

蜂膠（Propolis）是蜜蜂工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的一種天然粘稠物質。蜂膠的應用歷史十分悠久，早在公元前300年，古埃及人就將其作為防腐物質及防治疾病的藥物來使用。現代研究表明，蜂膠含有豐富的黃酮類、酚酸類及萜烯類化合物［1-3］，具有廣泛的生物學活性和藥理學活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調節等；目前已廣泛用于醫藥、保健品、化妝品等領域［4］。蜂膠在全世界范圍內均有分布，其中，巴西因其得天獨厚的地理位置和豐富的生物資源而成為蜂膠生產大國。巴西蜂膠種類繁多，化學組成復雜，具有豐富而突出的生物學活性。自20世紀90年代以來，巴西蜂膠的化學組成及其生物學活性引起了國內外蜂膠研究者的廣泛關注。惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病之一，其發病機制及防治措施多種多樣，本文針對巴西蜂膠抗肝癌HepG2細胞增殖活性進行研究，以期發現較好活性，為肝癌防治提供參考。

1　試驗材料

1.1材料和試劑

巴西蜂膠由天津市益倍建生物技術有限公司提供；噻唑藍（MTT）：美國Sigma公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程公司；二甲基亞砜：Sigma公司；RPMI1640、胰蛋白酶：Gibco公司。

1.2細胞株

肝癌HepG2細胞株：華中科技大學提供。

1.3試驗儀器

酶標儀：美國 PerkinElmer公司；CO2培養箱：W200IR型，美國SIM公司；倒置顯微鏡：Olympus公司；超凈工作臺：ZHJH-1112B型，上海智誠分析儀器制造有限公司。

2　方法

2.1藥物制備

巴西蜂膠以80%乙醇浸泡24 h，低溫回收乙醇，制得提取物。巴西蜂膠提取物適量以1 mL（DMSO）二甲基亞砜溶解，過濾除菌，置4℃冰箱保存，臨用前用培養基稀釋成所需濃度。

2.2HepG2細胞培養

將恒溫水浴鍋的溫度設置為37℃，在-80℃的低溫冰箱里取出已凍存的肝癌HepG2細胞株，放入恒溫水浴鍋中進行水浴，同時不停搖晃，使細胞迅速融化。3 min后凍存管內成液體狀態，取出后防止污染可用酒精棉擦拭。放入超凈工作臺后，取出離心管并加入3 mL的培養基，反復吹打后將凍存管內細胞懸液加入離心管里，吹勻后放入離心機（1 500 r/min，10 min）。離心后在超凈工作臺內操作，倒掉離心管內的上清液，加入1 mL培基后分裝到3個中型培養瓶內培養，每瓶加入6 mL培養基。將中型培養瓶放入37℃、5%CO2培養箱內培養。

2.3MTT法測定抑制率

2.3.1鋪板

觀察細胞狀態，細胞成對數生長期后，用胰酶消化，倒掉胰酶后，加入3 mL培養基終止消化，用吸管反復吹打但不要產生泡沫，將瓶壁的細胞吹落。吹勻后進行細胞計數，經計算配成3×104個/mL懸液，將細胞懸液接種于96孔板內，每孔100 μL（3×104個/mL）．放入37℃、5%CO2培養箱內培養24 h。

2.3.2給藥

在超凈工作臺內用RPMI 1640稀釋巴西蜂膠提取物母液，配置成6個質量濃度，分別為2.18、1.09、0.5 45、0.2727、0。136 35、0.068 175 g/mL。每個質量濃度設置6個平行孔，每孔加入100 μL藥物，空白孔加100 μL（3×104cell）的細胞懸液后，加入100 μL的RPMI 1640，平行條件下鋪3塊板。

2.3.3MTT法測定

將分別培養24、48、72 h的96孔板取出，倒掉板孔內液體，再在每孔加入10 μL MTT，放入培養箱內繼續培養4h后取出96孔板。吸去孔內MTT后，每孔再加入110 μL的Formazan溶解液，震蕩儀上震蕩10 min，使孔內結晶充分溶解。570 nm波長下酶標儀檢測。

2.3.4計算公式

HepG-2細胞生長抑制率/%=（1-給藥孔OD值/空白孔OD值）×100

2.3.5數據處理

本實驗采用SPSS19.0進行分析，使用ANOVA方差分析方法、兩樣本均數比較用t檢驗，結果以x±S表示。

3　結果

MTT結果顯示不同質量濃度的巴西蜂膠分別培養24、48、72 h后，對HepG2細胞有明顯抑制作用。當巴西蜂膠濃度大于等于0.272 7 mg/mL并培養48小時和72小時后，對HepG2細胞的抑制率均大于50%。當濃度增大為2.18 mg/mL時，作用24 h其抑制率即大于50%，具體數據見表1。巴西蜂膠相對應的IC50值經計算，分別為1.395 7、0.323 6、0.025 2mg/mL。各實驗組（P＜0.05）均有統計學意義，隨著濃度增大和作用時間延長，巴西蜂膠對HepG2細胞增殖抑制存在著顯著的劑量-效應關系和時間-效應關系（P＜0.05），見圖1。

表1　巴西蜂膠對HepG2細胞的抑制率（x±SD，n=6）Table 1　Inhibitory rate of Brazilian propolis on HepG2 cells（x±SD，n=6）

圖1 巴西蜂膠對HepG2細胞的抑制率曲線Fig.1　Inhibition curve of Brazilian propolis on HepG2 cells

4　結論與討論

通過本實驗可以看出，巴西蜂膠體外具有良好的抑制HepG2細胞增殖的活性，且隨著濃度的增加，作用時間的延長，對HepG2細胞的抑制率越高，在濃度為2.18 mg/mL時，其作用48 h和72 h的抑制率分別可達81.67%和93.86%，但是其在體內是否較好的抗肝癌活性及作用機制尚不清楚，仍需進一步深入研究。

我國是一個肝病大國，每年的肝癌發病率及病死率均占全球一半以上［5］，現有的抗肝癌藥物大都存在各種毒副作用。蜂膠是衛生部公布的可用于保健食品中的物品之一，具有較高的安全性［6］。且文獻報道其還有提高免疫的作用，在人們日益追求健康的時代，具有極大的開發為防治肝癌的藥品及保健食品的潛力，這對人類健康有著非常重要的現實意義。

［1］張翠平，胡福良．蜂膠中的黃酮類化合物［J］.天然產物研究與開發，2009，21（6）：1084-1090

［2］張翠平，胡福良．蜂膠中的萜類化合物［J］.天然產物研究與開發，2012，24（7）：976-984

［3］Zhang C，Wang K，HU Fuliang．Phenolic acid in propolis［J］．Chin J Mod Appl Pharm，2013，30（1）：102-105

［4］VS Bankova，SLD Castro，MC Marcucci.Propolis：recent advances in chemistry and plant origin［J］.Apidologie，2000，31（1）：3-15

［5］梁宏元，盧再鳴.原發性肝癌綜合介入治療現狀與困惑［J］.臨床肝膽病雜志，2016，32（1）：44-48

［6］程曉雨，胡福良.我國蜂膠保健食品概況［J］.中國蜂業，2015，66 （4）：45-47

Study on the Proliferation Inhibitory Activity of Brazilian Propolis on HepG2 Cell

LI He-yu1，ZHAO Ling2
（1.Tianjin Ubasic Health Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；2.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The Brazilian propolishas rich and significant physiological activity.The proliferation inhibitory activityof Brazilian propolis extracts on HepG2 cell was studied with the MTT assay.It was found that the Brazil propolis had good inhibitory activity on the proliferation of HepG2 cells，and showed a significant dose effect and time effect relationship，that was，the higher the dose，the longer the action time，the higher the inhibition rate of HepG2 cells.

Brazil propolis；HepG2 cell；proliferation inhibition activit

2016-07-12

李赫宇（1982—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：天然藥物和功能性食品的開發。