堿溶酸沉法提取黑木耳蛋白質研究

趙玉紅，林洋，張智，王振宇（.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱50040；2.哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱50090）

堿溶酸沉法提取黑木耳蛋白質研究

趙玉紅1，林洋1，張智1，王振宇2,*
（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱150090）

為優化黑木耳蛋白質的堿溶酸沉法提取工藝，考察料液比、提取時間、提取溫度、堿液濃度對黑木耳蛋白質得率的影響。采用響應面法優化黑木耳蛋白質提取的工藝條件。結果表明：黑木耳蛋白質的最佳提取工藝參數為：提取溫度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取時間2.5 h、堿液濃度0.07 mol/L。在此最佳條件下，黑木耳蛋白質的得率為4.52%。由此可知，堿溶酸沉法可以較好地提取黑木耳蛋白質。

黑木耳；提取；蛋白質；響應面優化

黑木耳（Auricularia auricula），又名云耳、光木耳、木菌、樹雞，木耳科木耳屬。性平味甘，具有滋補、潤燥、養血益胃、潤肺的作用［1］。常食用可益氣養神、滋陰潤燥，增強抵抗力，延年益壽。黑木耳富含蛋白質、氨基酸、多糖、及鈣、鐵、磷等人體所需的礦物質元素［2-5］。黑木耳作為一種營養豐富的食用菌，具有很高的研究和利用價值。

國內外對黑木耳的研究主要集中在黑木耳多糖的提取和功能性質研究［6-10］，對其含有的蛋白質研究較少，文獻報道的有劉靜波等人［11］采用酶法提取黑木耳膠原蛋白，產品得率為1.07%；王振宇等［12］采用傳統水提法提取黑木耳蛋白質，產品得率為2.6%。黑木耳以蛋白質含量高、脂肪熱量低等優勢，已成為獲取植物蛋白的新興資源，而傳統水提法和酶法提取的黑木耳蛋白質的得率都較低，不利于后續應用，因此提取方法有待進一步改進。常規的植物蛋白提取方法有堿溶酸沉法、酶法、非蛋白質法、復合法等［13-15］，其中堿溶酸沉法具有簡單易行、成本低、提取得率及純度較高等特點，目前國內外對采用堿溶酸沉法提取黑木耳蛋白質的研究尚鮮見報道。本文采用堿溶酸沉法提取黑木耳中蛋白質，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化黑木耳蛋白質的提取工藝，為黑木耳蛋白質提取效率的提高和進一步利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑木耳：采摘自黑龍江省大興安嶺，自然風干后粉碎過100目篩，石油醚脫脂24 h。

試劑：氫氧化鈉、石油醚、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、濃磷酸，均為分析純，購于哈爾濱市盛達試劑化學有限公司。

1.2儀器與設備

DK-S12型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；TDL-5W型臺式低速離心機：湖南星科科學儀器有限公司；722型可見光分光光度計、YP2001N型臺秤：上海精密科學儀器有限公司；JA-2003型分析天平：上海良品儀器儀表有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司等。

1.3方法

1.3.1標準曲線的制備

取0.1 mg/mL牛血清蛋白標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于6只試管中，加水至1.0 mL，之后各加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250，振蕩，充分混合，5 min后在595 nm波長下測定吸光度［16］。以蛋白質含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=0.007 2x+0.020 9（R2=0.997）。

1.3.2黑木耳蛋白質得率的計算

取黑木耳粉進行堿法提取，離心，得上清液。考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質含量，蛋白質得率公式如下：

式中：M1：上清液中蛋白質含量，mg/g；M2：原料質量，mg/g。

蛋白質沉淀率公式如下：

式中：M1：提取液中蛋白質含量，mg/g；M2：沉淀后上清液中蛋白質含量，mg/g。

1.3.3黑木耳蛋白質等電點的確定

在最佳提取條件提取黑木耳蛋白質，將提取液分裝于50mL燒杯中，每個30mL，用1mol/LHCl調提取液pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。8 000 r/min離心20 min，取上清液采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，計算蛋白質沉淀率。

1.3.4黑木耳蛋白質提取單因素試驗

1）提取時間對蛋白質得率的影響取黑木耳粉1 g，按料液比1∶50（g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，40℃水浴，分別提取1、1.5、2、2.5、3、3.5 h。4000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定黑木耳中蛋白質含量。

2）料液比對蛋白質得率的影響 取黑木耳粉1 g，按不同料液比（1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶110、1∶130，g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，40℃水浴2.5 h。4000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定黑木耳中蛋白質含量。

3）堿液濃度對蛋白質得率的影響 取黑木耳粉1g，按料液比1∶50（g/mL）加入不同濃度（0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L）NaOH溶液，攪拌均勻，40℃水浴2.5 h，4000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定黑木耳中蛋白質含量。

4）提取溫度對蛋白質得率的影響 稱取黑木耳粉1 g，按料液比1∶50（g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，不同溫度下（35、40、45、50、55、60℃）水浴提取2.5 h。4 000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定黑木耳中蛋白質含量。

1.3.5響應面試驗

在單因素試驗基礎上，以提取時間、料液比、堿液濃度為自變量，蛋白質得率為響應值，建立回歸方程模型。根據Design-Expert 8.0.5軟件Box-Benhnken原理采用響應面法在三因素三水平對黑木耳蛋白質的提取條件進行優化，試驗設計方案見表1。

表1 試驗因素水平及編碼表Table 1　Vairables and levels in Box-Benhnken experimental design

2　結果與討論

2.1堿法提取黑木耳蛋白質的單因素試驗

2.1.1提取時間對蛋白質得率的影響

提取時間對蛋白質得率的影響見圖1。

圖1　提取時間對蛋白質得率的影響Fig.1　The effect of extraction time on protein yield

由圖1可知，蛋白質得率隨時間的增加增幅明顯，黑木耳蛋白質不斷被浸提出來。當提取時間為2.5 h時達到提取平衡，提取曲線呈現平緩趨勢。這與謝昊宇等應用堿法提取青稞蛋白質［17］結果一致。這是由于在提取初期提取時間過短，原料尚未完全與溶液接觸，此外，黑木耳粉末中的膠質和蛋白質結合的網狀結構不易被破壞，蛋白質被包容在結構網內難以分離；而提取時間過長，多糖從膠質中分離出來，增加了體系的黏度，使多糖和蛋白質不易分離，離心效果受到影響。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質最佳提取時間為2.5h。

2.1.2料液比對蛋白質得率的影響

料液比對蛋白質得率的影響見圖2。

圖2 料液比對蛋白質得率的影響Fig.2　The effect of in solid-liquid ratio on protein yield

由圖2可知，隨料液比的逐漸增大，蛋白質得率增加，當料液比達到1∶90（g/mL）時，蛋白質得率達到最大值。原因可能是隨著溶劑體積的增加，原料在溶劑中的分散度和接觸面積增大，加速了黑木耳蛋白質的溶出，當繼續增大溶劑體積到一定量時，原料的接觸面積沒有很大變化，蛋白質得率變化緩慢。與Jianmei等提取花生蛋白的結果一致［18］。由于黑木耳中富含粘性多糖，其在水溶液中能產生很高的粘度，阻礙蛋白質提取中的傳質過程，因此只有當堿液提取的溶出效應與粘性多糖的阻遏效應達到平衡時，才能使蛋白質的得率達到峰值。此外，過大的料液比會造成提取液中蛋白質濃度偏低，不利于后續的蛋白質絮凝沉淀，同時還會增加廢水產生量和處理成本。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質提取最佳料液比為1∶90（g/mL）。

2.1.3堿液濃度對蛋白質得率的影響

堿液濃度對蛋白質得率的影響見圖3。

圖3　堿液濃度對蛋白質得率的影響Fig.3　The effect of alkali concentration on protein yield

由圖3可知，隨NaOH濃度的增加，蛋白質得率逐漸變大，當NaOH濃度達到0.07 mol/L時，蛋白質得率達到最大值。這與王振斌等采用響應面優化芝麻餅粕蛋白的制備［19］結果一致。原因可能為黑木耳蛋白質的溶解性隨NaOH濃度的增加而增大，但過高的NaOH濃度會使蛋白質變性，促使美拉德反應的發生，導致必須氨基酸的損失。同時降低蛋白質的營養價值和得率，而且會顯著增加提取液的粘度，不利于后續的離心分離，造成蛋白質的損失較多。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質提取最佳NaOH濃度為0.07 mol/L。

2.1.4提取溫度對蛋白質得率的影響

提取溫度對蛋白質得率的影響見圖4。

圖4　提取溫度對蛋白質得率的影響Fig.4　The effect of temperature on protein yield

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，蛋白質得率逐漸增大，當溫度達50℃時，蛋白質得率達到最大值。當溫度高于50℃時，隨著溫度的升高，蛋白質得率逐漸下降。這與李加興等采用堿提酸沉法提取黃秋葵蛋白質［20］結果一致。這是由于溫度的上升使蛋白質的構象發生改變，分子的立體結構變得伸展，有利于蛋白質分子和水分子的相互作用，使蛋白質的溶解性增大，促進了蛋白質的溶出。而過高的提取溫度維持蛋白質空間構象的次級鍵被破壞，促進了蛋白質分子間相互結合而形成沉淀，使得蛋白質變性，增加了提取液的粘度，不利于蛋白質的溶出，其得率也隨之下降。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質提取的最佳溫度為50℃。

2.2響應面優化試驗

2.2.1響應面試驗結果

以料液比、提取時間、堿液濃度3個因素為響應變量，黑木耳蛋白質得率為響應值，采用響應面分析法進行三因素三水平試驗設計。響應面試驗設計及分析見表2。

回歸方程為：

得率 =4.516+0.1A+0.08B+0.17C+0.02AB-0.065AC-0.105BC-0.318A2-0.243B2-0.493C2

表2 響應面分析方案與試驗結果Table 2　Response surface analysis program with test results

表3　黑木耳蛋白質得率回歸方差分析Table 3　Auricularia auricular protein yield regression analysis of variance

為了驗證模型的有效性，進行了方差分析，結果見表3。由表3可知，影響顯著因素為A、BC、B，極顯著因素為C、A2、B2、C2，AB、AC影響不顯著。在所選的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序：C＞A＞B，即堿液濃度＞料液比＞提取時間。3個因素中，提取時間和堿液濃度之間存在較為顯著的交互作用。由響應面分析得相關系數R2為0.989 0，說明黑木耳蛋白質得率的試驗值與預測值之間有很好的擬合度。由表3方差分析的結果可以看出方程的失擬項不顯著，表明該方程對試驗擬合情況好，誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對結果進行分析和預測［21］。

2.2.2等高線和響應面分析

根據黑木耳蛋白質得率回歸模型做出相應的二維等高曲線圖與三維球面圖，見圖5～圖7。

圖5　提取時間和料液比對蛋白質得率的影響Fig.5　The effect of extraction time and temperature on protein yield

圖6　堿液濃度和料液比對蛋白質得率的影響Fig.6　The effect of alkali concentration and solid-liquid ratio on protein yield

圖7　堿液濃度和提取時間對蛋白質得率的影響Fig.7　The effect of alkali concentration and extraction time on protein yield

響應面曲面坡度反映該因素對蛋白質得率影響的強弱程度。等高線密度反映蛋白質得率的變化程度，密度越大，響應面越陡，密度越小，響應面越平。等高線的位置與形狀反映交互作用的強弱，形狀趨近于橢圓形表示兩因素交互作用對蛋白質得率影響顯著，形狀趨近于圓形表示兩因素交互作用對蛋白質得率影響不顯著［22］。由圖5、圖6可知，隨著提取時間、料液比堿液濃度的逐漸增大，蛋白質得率曲線呈先增加后降低趨勢，存在最高點，觀察圖中曲面較平滑，等高線近似圓形，說明提取時間與料液比交互作用不顯著。由圖7可知，隨堿液濃度的增加，蛋白質得率增幅非常明顯且存在最高點，觀察圖中曲面較陡峭，等高線呈橢圓形，說明彼此之間交互顯著，與方差分析結果一致。由此可知，適當增加提取時間、堿液濃度和料液比可提高其蛋白質得率。

2.2.3驗證試驗

根據響應面分析所得結果和二次多項式方程，利用Design-Expert軟件計算出最佳提取條件為：提取溫度50℃、料液比1∶93（g/mL）、提取時間2.57 h、堿液濃度0.0714 mol/L，此時預期蛋白質得率為4.54%。為便于操作，將上述條件參數進行修正為：提取溫度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取時間2.5h、堿液濃度0.07mol/L。根據修正后的工藝條件進行3次驗證試驗，此時黑木耳蛋白質得率為4.52%，與理論值相比降低了0.44%，可見該模型較好地預測了試驗結果。

3　結論

影響黑木耳蛋白質得率的主要因素為提取時間和料液比，其次為堿液濃度和提取溫度，黑木耳蛋白質的等電點為pH3.5。在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗優化得出黑木耳蛋白質提取最佳工藝條件，為便于操作將其修正為：提取溫度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取時間2.5 h、堿液濃度0.07 mol/L。在此條件下，黑木耳蛋白質得率為4.52%。劉靜波、王振宇等［11-12］采用傳統水提法和酶法提取黑木耳蛋白質，產品得率僅為1.07%、2.6%，說明堿提酸沉法提取黑木耳蛋白質可以有效提高其得率，是提取黑木耳蛋白質較為適用的方法。

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Optimization of Alkali Extraction of Protein from Auricularia auricula

ZHAO Yu-hong1，LIN Yang1，ZHANG Zhi1，WANG Zhen-yu2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.School of Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

In order to optimize the extraction process of protein from Auricularia auricular，solid-liquid ratio，extraction time，temperature and alkali concentration were investigated for their effects.The optimal extraction conditions were explored by response surface methodology.The results showed that optimal protein extraction parameters were temperature 50℃，solid-liquid ratio 1∶90（g/mL），extraction time 2.5 h，alkali concentration 0.07mol/L.Under these conditions，the yield of protein from Auricularia auricular was 4.52%.The results indicated that this protein extraction method was distinctly effective when applied on Auricularia auricular.

Auricularia auricular；extraction；protein；response surface optimization

2015-09-25

黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目（GA13B202）

趙玉紅（1968—），女（漢），副教授，博士，研究方向：林特產品精深加工。

王振宇，教授，博士，研究方向：植物活性物質及功能食品。