白藜蘆醇分子印跡聚合物的應用及性能研究

馮濤，劉鵬，劉海燕，鎖然（.河北農業大學理學院，河北保定07000；.河北大學工商學院實驗管理中心，河北保定07000；.河北農業大學食品科技學院，河北保定07000）

白藜蘆醇分子印跡聚合物的應用及性能研究

馮濤1，劉鵬2，劉海燕1，鎖然3
（1.河北農業大學理學院，河北保定071000；2.河北大學工商學院實驗管理中心，河北保定071000；3.河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

采用分子印跡技術以白黎蘆醇為模板分子，選擇丙烯酰胺作為白藜蘆醇印跡聚合物的功能單體，氯仿和四氫呋喃的混合溶液作為印跡聚合物合成溶劑，制備了白黎蘆醇分子印跡聚合物，考察了分子印跡聚合物的吸附性能、選擇性能以及固相萃取性能。優化分子印跡固相萃取的萃取條件，選擇30%（體積分數）的乙醇-水溶液5 mL作為上樣溶液，選擇40%（體積分數）的乙醇-水溶液作為淋洗液、80%（體積分數）的乙醇-水溶液作為洗脫液。

虎杖；白藜蘆醇；高效液相色譜；提取純化；分子印跡

白藜蘆醇具有多種生物活性，主要包括抗腫瘤、心血管保護、防治骨質疏松、抗氧化和清除自由基等［1-2］。白藜蘆醇在常見的藥用植物中廣泛存在，如虎杖、決明、藜蘆等。但是由于其在天然植物中的含量較低，分離純化得到高含量成品的成本較高，大大限制了其在醫藥、保健食品等領域中的推廣應用。國內外生產和銷售白藜蘆醇的企業，均以天然植物（葡萄或中藥虎杖）為原料來提取分離白藜蘆醇。目前，白藜蘆醇的分離純化主要采用有機溶劑提取、硅膠柱層析或大孔吸附樹脂吸附等方法。但是，這些分離純化方法有機溶劑消耗量大，環境污染嚴重，操作相對繁瑣，產率低，產物雜質較多；高速逆流色譜、超臨界流體色譜技術在分離純化白藜蘆醇方面得到了較好效果，產品純度高，但其生產設備昂貴，提取成本相對較高［3-7］。因此，探索新的分離純化技術，提高分離純化效率尤為重要。本文擬采用分子識別性能好的分子印跡聚合物進一步純化白藜蘆醇粗提物，達到簡化提取物純化過程、提高白藜蘆醇分離純化效率的目的。

1　材料與方法

1.1主要試驗儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（配DAD檢測器）：美國Agilent；色譜柱，Diamonsil C18柱（250 mm× 4.6 mm×5 μm）：北京華瑞博遠科技有限公司；FD5-2.5真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；DF-101S 78-1磁力恒溫加熱攪拌器：國華電器有限公司；BS 224 S電子分析天平：美國sartorius公司；KUDOS SK5200H超聲波清洗器：天津市瑞普電子儀器公司。

1.2主要試驗試劑及材料

虎杖：河北安國藥材市場；白藜蘆醇（Res）純品（≥98%）：天津市尖峰天然產物研究開發有限公司；丙烯酰胺（AM），分析純：天津醫藥公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）：德國FLUKA公司；偶氮二異丁腈（AIBN），分析純：天津市福晨化學試劑廠；95%乙醇，分析純：天津市化學試劑廠；乙腈，色譜純：上海市化學試劑廠；純凈水：樂百氏。

1.3方法

1.3.1白藜蘆醇的高效液相色譜檢測方法

色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（40-60，體積比）；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；檢測波長：306 nm。

1.3.2白藜蘆醇分子印跡聚合物的制備方法［8-13］

聚合物的合成采用溶液聚合方法，以反式白藜蘆醇為模板分子、丙烯酰胺（AM）為功能單體、偶氮二異丁腈（AIBN）為引發劑進行自由基引發聚合。

稱取0.45 g（2 mmol）白藜蘆醇和0.71 g（10 mmol）功能單體丙烯酰胺充分溶解于（10 mL氯仿+5 mL四氫呋喃）混合溶液中，置于封閉管中超聲10 min后，放置3 h，使模板分子與功能單體充分發生作用，再加入8 g（40 mmoL）交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）和100 mg引發劑偶氮二異丁腈，充分混溶后，通氮氣脫氧10 min，在真空狀態下密封，然后于50℃恒溫水浴中聚合24 h，所得的棒狀聚合物用研缽磨碎并過200目孔篩，取粒徑小于75 μm的顆粒，用5%（體積分數）乙酸的甲醇溶液置索氏提取器中提取24 h，除去模板分子及未反應化合物，然后用乙腈洗滌除去殘留的乙酸和甲醇，聚合物顆粒經丙酮反復沉降，除去細顆粒后真空干燥，即為白藜蘆醇分子印跡聚合物（MIP）。空白聚合物的制備方法同上，但未加模板分子，得到非印跡聚合物（NMIP）。

2　結果與討論

2.1白藜蘆醇標準曲線的繪制

準確稱取白藜蘆醇對照品0.0250 g置于25 mL容量瓶中，用40%甲醇溶解定容，配成1 mg/mL標準儲備液備用，低溫、避光保存。分別準確取儲備液0.025、0.25、 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，用40%（體積分數）甲醇定容至25 mL，搖勻。分別相當于質量濃度為1.0、10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、240.0、280.0 μg/mL的標準溶液。用0.45 μm濾膜過濾，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以色譜峰面積A為縱坐標、白藜蘆醇質量濃度C為橫坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖1 白藜蘆醇的標準曲線Fig.1　Standard curve of resveratrol

由圖1可以看出，白藜蘆醇在質量濃度1.0 μg/mL～280.0 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，標準曲線的線性回歸方程A=52.33C＋106.21，線性相關系數r=0.999 3。

2.2白藜蘆醇分子印跡聚合物的制備

2.2.1白藜蘆醇分子印跡聚合物功能單體及溶劑的選擇

白藜蘆醇含有多個酚羥基，具有一定的極性，不溶于氯仿等非極性溶劑，一般認為在非共價分子印跡技術中，溶于極性溶劑的化合物不適宜作為模板分子。因此，合成白藜蘆醇印跡聚合物的功能單體必須能在極性溶劑中與白藜蘆醇形成氫鍵。甲基丙烯酸是分子印跡聚合物常用的功能單體。由于在極性溶劑中酰胺比羧酸能形成更強的氫鍵，因此，選擇丙烯酰胺作為白藜蘆醇印跡聚合物的功能單體，氯仿和四氫呋喃的混合溶液作為印跡聚合物合成溶劑。

2.2.2白藜蘆醇在分子印跡聚合物上的結合等溫線及結合特性

采用靜態平衡法測定印跡聚合物對不同濃度白藜蘆醇（Res）的結合等溫線。精確稱取10份相同的白藜蘆醇印跡聚合物粉末，分別置于10個10 mL離心管中，分別加入5 mL不同濃度（0.2 mmol/L～4.0 mmol/L）的白藜蘆醇-乙醇溶液，在25℃下恒溫振蕩8 h后，在1 000 r/min轉速下離心，取上清液用高效液相色譜法在306 nm波長處測定平衡溶液中的白藜蘆醇的含量，即吸附平衡濃度（Ce）。模板分子在印跡聚合物上的平衡吸附量（Q，mmol/g）可通過下式計算：

式中：C0和Ce分別為模板分子的起始濃度和平衡濃度，mmol/L；V為溶液的體積，mL；W為印跡聚合物的質量，g。

同時，按上述方法做空白聚合物（NMIP）的靜態吸附試驗。

通過靜態吸附試驗，研究了白藜蘆醇在印跡聚合物和非印跡聚合物上的吸附行為。MIP和NMIP對白藜蘆醇的結合等溫線見圖2。

圖2MIP和NMIP對白藜蘆醇的結合等溫線Fig.2　Binding isotherms of resveratrol on MIP and NMIP

由圖2可以看出，印跡聚合物對白藜蘆醇具有一定的吸附能力，而非印跡聚合物對白藜蘆醇吸附很小，表明印跡聚合物對白藜蘆醇確實具有印跡能力。白藜蘆醇可通過氫鍵和空間匹配達到吸附，而對于NMIP，雖然白藜蘆醇也能與聚合物上的酰胺健形成氫鍵，但由于位置關系，不具有作用位點的匹配性，每個白藜蘆醇分子往往只能與吸附劑形成一個氫鍵，這樣作用力遠小于MIP對白藜蘆醇的作用力，因此NMIP對白藜蘆醇吸附力很弱。

式中：Q和Qmax為平衡結合量，μmol/g和最大表觀結合量，μmol/g；Ce為溶液中平衡濃度，mol/L；KD為結合位點的平衡離解常數，mol/L。當以Q/Ce對Q作圖時，根據線性關系的斜率和截距可求得KD和Qmax兩個參數。

白藜蘆醇在MIP上的Scatchard分析見圖3。

圖3　MIP的Scatchard曲線Fig.3　The scatchard curve of MIP

由圖3可以看出，Scatchard曲線呈非線性相關性，說明白藜蘆醇在MIP上的結合位點的能量不均。將圖中散點分成兩部分，分別進行線性回歸，得到條不同斜率的直線，說明在所研究的模板分子濃度圍內，MIP主要存在著兩種不同能量的結合位點。根直線的斜率和截距，分別計算出兩種結合位點的離常數KD和最大表觀結合量Qmax。

對于高能結合位點，KD1和 Qmax1分別為 1.58× 0-4mol/L和36.61 μmol/g；對于低能結合位點，KD2和max2分別為2.38×10-3mol/L和125.37 μmol/g。MIP中產生有兩種不同結合能量的位點，這說明模板分子白藜蘆醇與功能單體預組織時可能存在著兩種組織方式，因而在MIP中就留下兩種結合位點。

2.2.3白藜蘆醇分子印跡固相萃取柱的制備及分離純化條件優化

稱取200 mg白藜蘆醇分子印跡聚合物粉末（過200目篩），均勻裝填進500 mg/3 mL的聚丙烯固相萃取空柱中，柱的上、下端均以聚乙烯微孔篩板固定。固相萃取過程中每次活化、上樣、淋洗及洗脫溶液的體積均為5 mL。固相萃取柱在每次使用前，依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。萃取柱的流速控制在1 mL/min左右，萃取過程中的溶液由高效液相色譜儀分析。

固相萃取的優點之一是萃取柱的負載量大，但使用不同溶劑時萃取柱的負載量也會隨之變化。因為白藜蘆醇易溶于乙醇，而且其他有機溶劑一般有不同程度的毒性，不宜應用在食品、醫藥領域，故選擇不同體積比的乙醇-水溶液作為上樣溶劑，分別檢測流出液中白藜蘆醇的含量，考察印跡和非印跡萃取柱對白藜蘆醇的吸附情況。

上樣溶液中乙醇的體積分數對白藜蘆醇吸附的影響見圖4。

圖4　上樣溶液中乙醇的體積分數對白藜蘆醇吸附的影響Fig.4　Effects of the volume fraction of ethanol on resveratrol adsorption in the sample solution

由圖4可知，當上樣溶液中乙醇的體積分數小于40%時，印跡萃取柱均可吸附大部分白藜蘆醇，而非印跡萃取柱在乙醇體積分數小于20%時才能吸附大部分白藜蘆醇；隨著上樣溶液中乙醇體積分數的逐漸增加，印跡和非印跡萃取柱的負載量均開始下降，但其在印跡聚合物上的吸附量要比在非印跡聚合物上的吸附量大。考慮到吸附量，選擇含體積分數為30%的乙醇-水溶液5 mL作為上樣溶液，該試驗條件可確保大部分白藜蘆醇能被吸附。

淋洗液、洗脫液的選擇也非常重要。淋洗溶劑的強度必須達到能夠洗掉盡量多的不需要組分，但不能強到洗脫目標物的程度。根據上樣溶液中乙醇的體積分數對白藜蘆醇吸附的影響曲線，選擇40%（體積分數）的乙醇-水溶液作為淋洗液、80%（體積分數）的乙醇-水溶液作為洗脫液。

按上述選擇的條件進行固相萃取操作，每隔0.5mL分別收集一次洗脫液，檢測各洗脫液中的白藜蘆醇含量，計算回收率，考察白藜蘆醇的洗脫分布情況，以確定適宜的洗脫液收集體積。

白藜蘆醇的洗脫曲線見圖5。

圖5　白藜蘆醇的洗脫曲線Fig.5　The elution curve of resveratrol

由圖5可以看出，白藜蘆醇集中在第1.5mL～4.5mL體積內，因此，收集液的體積可控制在3 mL，在一定程度上起到了濃縮樣品的作用。

2.2.4虎杖提取物的分離純化

稱取2.0 g虎杖粗粉，加入60%（體積分數）乙醇20 mL，在35℃下超聲提取20 min，以水定容至50 mL，混勻、靜置，過濾。按上述分子印記固相萃取方法操作，收集洗脫液，用氮氣吹干后以甲醇溶解定容，用高效液相色譜儀檢測白藜蘆醇，并與固相萃取前的提取液對比。

虎杖提取液的色譜圖見圖6，洗脫液的色譜圖見圖7。

由圖6可以看出，虎杖提取液所含成分較多，而經過分子印記固相萃取后，洗脫液中主要成分為白藜蘆醇，只含有少量的雜質（圖7）。比較上樣前與洗脫后的溶液中白藜蘆醇的總量，計算出白藜蘆醇的收率為73.6%，洗脫液中白藜蘆醇的純度為89.2%。

圖6 虎杖提取液的色譜圖Fig.6　The chromatotogram of Polygonum cuspidatum extract

圖7 洗脫液的色譜圖Fig.7　The chromatotogram of the eluent

3　結論與展望

結果表明，分子印跡聚合物的Scatchard模型的功能單體與模板分子白藜蘆醇與預組織時可能存在著兩種組織方式。這使得分子印跡聚合物對模板分子具有高度的選擇性和專一的識別性，采用固相萃取法將該分子印跡聚合物直接用于復雜體系（虎杖提取液）中白黎蘆醇的分離純化，樣品僅經一步處理，即可除去大部分雜質，達到良好的分離效果，展示了該技術的應用前景。

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Application and Performance Study of Molecular Imprinted Polymer of Resveratrol

FENG Tao1，LIU Peng2，LIU Hai-yan1，SUO Ran3
（1.College of Science，Agricultural Univercity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.Experimental Management Center，Business School，Hebei Univercity，Baoding 071000，Hebei，China；3.College of Food
Science and Technology，Agricultural Univercity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Molecular imprinting technolog was adopted to prepare resveratrol molecularly imprinted polymer，with resveratrolas template molecule，with acrylamide as functional monomer of resveratrol molecularly imprinted polymer.Mixed solution of chloroform and tetrahydrofuran were selected as solvent to synthesis molecularly imprinted polymer.The performance of the molecularly imprinted polymer，such as adsorption，selection and solid phase extraction were studied.By optimized the extraction condition of molecularly imprinted solid phase extraction，it was determined that ethanol aqueous solution（30%）5 mL was the in-flux solution，ethanol aqueous solution（40%）was spraying，ethanol aqueous solution（80%）was eluent.

polygonum cuspidatum；resveratrol；HPLC；extraction and purification；molecular imprinting

2015-08-18

科技支撐計劃項目（16ZF028）

馮濤（1980—），女（漢），實驗師，研究生，研究方向：分析化學。