殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒的工藝優化

秦珂，孫靜（.山東省萊蕪市第一中學，山東萊蕪2700；2.萊蕪職業技術學院生物教研室，山東萊蕪2700）

殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒的工藝優化

秦珂1，孫靜2，*
（1.山東省萊蕪市第一中學，山東萊蕪271100；2.萊蕪職業技術學院生物教研室，山東萊蕪271100）

采用殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒。在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗確定固定化果膠酶澄清低度姜酒的最優工藝為：固定化酶濃度為60 g/L，pH值為3.5，酶解溫度和時間分別是45℃和12 h。在該工藝下低度姜酒透光率可達98.9%，所得低度姜酒穩定性好，殼聚糖固定化果膠酶重復使用7次后姜酒透光率仍保留有81.2%。固定化果膠酶比游離酶澄清低度姜酒效果好，穩定性提高。

殼聚糖；固定化酶；果膠酶；低度姜酒；澄清

果膠酶作為一種有效的澄清劑，利用果膠酶水解引起混濁的果膠物質廣泛用于果汁、果酒的澄清［1-2］，研究人員之前已進行了果膠酶澄清低度姜酒的研究［3］，但由于游離的果膠酶穩定性較差，易失活，價格高，不易回收利用，而固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增加穩定性、可反復或連續使用以及易于和反應物分開等顯著優點成為當今研究熱點［4-7］。本文以戊二醛為交聯劑，殼聚糖為載體制備固定化果膠酶，應用于低度姜酒的澄清工藝中，確定最佳工藝參數，以期為低度姜酒的澄清工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

殼聚糖（食品級）：上海卡博工貿有限公司生產；果膠酶（食品級，粉末狀）：鄭州眾信化工產品有限公司；TGL18臺式離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器：金壇市華偉儀器廠；UV-2102PC紫光可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA1004電子分析天平：上海市百典儀器廠；抽濾裝置等。

1.2方法

1.2.1工藝流程［3］

生姜→姜酒→酶解→過濾→灌裝→檢驗→成品

1.2.2殼聚糖固定化果膠酶的制備

100 mL 1%冰醋酸中加殼聚糖1 g，攪拌均勻，滴入10%NaOH溶液至pH 7.0，加入5%戊二醛，攪拌靜置抽濾并用去離子水洗至中性后加入果膠酶液（果膠酶/殼聚糖=10 mg/1 g），緩慢振蕩混合30 min左右，4℃條件下固定12 h，用蒸餾水沖洗、抽干制得固定化果膠酶［8］。

1.3測定方法［3］

低度姜酒澄清度、色度的測定：采用分光光度計法，分別以透光率值T670、A420表示。

可溶性固形物：糖度計法。

總糖：直接滴定法，以葡萄糖計（GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》）。

總酸：滴定法。

總酚：Folin—Denis法。

穩定性研究：通過將酒液冷凍到接近其冰點，觀察有無沉淀現象及瓶底沉淀物的多少。

1.4固定化果膠酶澄清低度姜酒的工藝參數確定

1.4.1單因素試驗

研究固定化酶用量（濃度）、pH值、酶解時間、反應溫度4個因素對固定化酶澄清低度姜酒的影響。

1.4.2正交試驗

以透光率作為質量指標，根據單因素試驗結果，以果膠酶濃度、pH值、酶解時間、溫度進行四因素三水平正交試驗，確定最優固定化果膠酶澄清條件。

1.5最優條件澄清低度姜酒的效果評價

在最優條件下進行3組平行試驗，對固定化果膠酶處理前后低度姜酒的透光率T670、吸光度A420、可溶性固形物、總酸、總酚、穩定性進行評價。

1.6殼聚糖固定化果膠酶的操作穩定性

在最優條件下，連續使用固定化果膠酶澄清低度姜酒10次，測定低度姜酒的澄清度，試驗平行3次，每次使用后用去離子水清洗殼聚糖固定化酶，抽干。

2　結果與分析

2.1固定化果膠酶澄清低度姜酒單因素試驗結果

2.1.1固定化果膠酶濃度的影響

分別在一定量的低度姜酒中加入30、40、50、60、70 g/L固定化果膠酶，調pH值為4，45℃下酶解12 h，取上清液測透光率。試驗平行3次，結果顯示透光率隨固定化果膠酶濃度增加而升高，當加酶量增加至60 g/L以上時，透光率的增幅較小。故選用50 g/L～70 g/L范圍用于正交試驗。

2.1.2固定化果膠酶酶解溫度的影響

在一定量的低度姜酒中加入固定化果膠酶60 g/L，調節pH值為4，溫度分別為30、40、45、50、55℃，酶解12 h，取上清液測透光率。試驗平行3次，結果顯示隨溫度升高，低度姜酒透光率先增加后下降；45℃時，透光率達到最大，故選用40℃～50℃范圍用于正交試驗。

2.1.3固定化果膠酶酶解時間的影響

在一定量的低度姜酒中加入固定化果膠酶60 g/L，調節pH值為4，溫度45℃，分別酶解3、6、9、12、15 h，取上清液測透光率。試驗平行3次，結果顯示，透光率隨酶解時間的延長而升高；12h時，透光率達到最大，當酶解時間達到12 h以上時，透光率的增加較緩慢，說明酶解反應已基本完成，故選用9 h～15 h范圍用于正交試驗。

2.1.4固定化果膠酶酶解pH值的影響

在一定量的低度姜酒中加入固定化果膠酶60 g/ L，45℃酶解12 h，調pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，取上清液測透光率。試驗平行3次，結果顯示低度姜酒透光率在pH值為3.5之前，呈急速上升趨勢，在pH值為3.5時達到最大值，超過3.5后，又呈下降趨勢。說明pH 3.5為固定化果膠酶的最適pH值，故選用pH值為3.0～4.0范圍用于正交試驗。

2.2酶解的正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，對酶用量（A）、作用溫度（B）、酶解時間（C）、pH值（D）進行綜合研究，選用L9（34）正交表進行試驗，以透光率作為質量指標，結果見表1。

表1　固定化果膠酶澄清低度姜酒正交試驗結果Table 1　Results of orthogonal test L9（34）for clarifying low-ginger liquor of the immobilized pectinase

由表1極差分析可知，影響低度姜酒透光率的因素順序是作用溫度（B）＞pH值（D）＞固定化果膠酶用量（A）＞酶解時間（C）。固定化果膠酶澄清低度姜酒的最佳水平為：A2B2C2D2，即最佳酶解工藝條件為：酶量為60 g/L，溫度為45℃，pH值為3.5，酶解時間為12 h。

2.3最優條件下固定化果膠酶澄清低度姜酒效果評價

為探討最優條件澄清低度姜酒的效果，以固定化果膠酶用量為60 g/L，處理溫度為45℃，處理pH值為3.5，酶解時間為12 h進行試驗，以透光率、色度、可溶性固形物、總酸、總酚、穩定性等為指標，測定澄清前后低度姜酒各項指標變化結果見表2。

由表2可知，固定化果膠酶處理低度姜酒后，透光率為98.9%，提高22.86%，吸光度、總酚含量、可溶性固形物、總糖、總酸含量分別降低79.65%、54.37%、16.95%、20.31%、16.89%，穩定性增加。固定化果膠酶的澄清效果要比單獨使用游離酶要好［3］。這可能是因為殼聚糖是天然的陽離子型絮凝劑，對蛋白質、多酚、果膠等具有良好的吸附和絮凝作用，殼聚糖和果膠酶二者結合，有利于提高澄清效果、降低成本［9-10］。

表2　最優澄清處理對低度姜酒相關指標的影響Table 2　Effects of clarifying treatments on related indicators of low-ginger liquor

2.4殼聚糖固定化果膠酶的操作穩定性

為了研究固定化酶的穩定性，對固定化果膠酶連續進行10批次澄清姜酒的操作，結果見表3。

表3　殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒的操作穩定性Table 3　Stability of immobilized pectinase on clarification of low-ginger liquor

由表3可知，隨著固定化果膠酶澄清姜酒重復次數的增加，姜酒透光率逐漸下降，可能是因為殼聚糖固定化果膠酶本身失活以及回收過程中損失引起的［5-6］。連續使用7次后，姜酒透光率仍能達到81.2%，說明該固定化酶具有一定的操作穩定性。相比單純使用游離果膠酶，殼聚糖固定化酶可反復或連續使用，降低成本，提高酶的穩定性。

3　討論與結論

殼聚糖是氨基葡萄糖的直鏈多聚糖，對人體無毒、無害［8］，采用殼聚糖作為載體制得的固定化酶，機械強度大，穩定性好，重復利用率高，降低了生產成本、提高了產品質量［11］。

固定化果膠酶酶解低度姜酒，相對單獨使用游離酶，澄清效果好，研究表明，最佳工藝條件為：酶量為60 g/L，溫度為45℃，pH值為3.5，酶解時間為12 h。在此條件下所得姜酒透光率為98.9%，所得姜酒清徹透明，黃色至金黃色，久置無分層，無懸浮物，穩定性好，提高了低度姜酒的質量。

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Optimization the Technology of Low-ginger Liquor Clarification by the Pectinase Immobilized with Chitosan

QIN Ke1，SUN Jing2，*
（1.Laiwu No.1 Senior High School Shandong Province，Laiwu 271100，Shandong，China；2.Biochemistry Staff
Room，Laiwu Vocational Technology Institute，Laiwu 271100，Shandong，China）

Chitosan-immobilized pectinase was applied to clarify low-ginger liquor.Based on the result of single factor experiments，orthogonal experiment was performed.The optimizate conditions for charification of lowginger liquor were：immobilized enzyme amount 60 g/L，pH value 3.5，enzymolysis temperature 45℃，enzymolysis time 12 h，transmittance reached 98.9%，The transmittancy of low-ginger liquor was 81.2%after immobilized enzyme was repeatedly used seven times.The clarification effects of immobilized enzyme were better than free enzyme.

chitosan；immobilized enzyme；pectinase；low-ginger liquor；clarification

2015-09-19

山東省科技發展計劃項目（2011GGA12054）；萊蕪高新區科技創新與發展計劃項目（201015）

秦珂（1998—），女（漢），高中，研究方向：生物、化學實驗研究。

孫靜，女（漢），副教授，研究方向：生物化工及生物化學教學及研究。