鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取工藝研究

黃愛妮，汪海波，李麗，胡小泓，周勝男（.武昌工學院食品工程學院，湖北武漢 430065；.武漢輕工大學化學與環境工程學院，湖北武漢43003）

鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取工藝研究

黃愛妮1，汪海波2，李麗1，胡小泓1，周勝男1
（1.武昌工學院食品工程學院，湖北武漢 430065；2.武漢輕工大學化學與環境工程學院，湖北武漢430023）

以鰱魚魚皮為原料，通過單因素試驗和正交試驗對鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取工藝參數進行分析，并用AR-500動態流變儀對鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度進行分析。結果表明：鰱魚魚皮原料中酸溶性膠原蛋白提取的最佳工藝條件為：以乙酸作為提取劑，乙酸濃度0.3 mol/L，料液比1∶60（g/mL），提取時間96 h；此膠原蛋白的熱變性起始溫度為32.31℃，峰值溫度為34.82℃。

鰱魚皮；酸溶性膠原蛋白；提取

膠原又稱膠原蛋白，是動物體內含量多、分布廣的蛋白質，約占體內蛋白質總量的25%～30%。膠原蛋白在傳統上主要是從陸生動物如豬、牛等的皮、骨中提取，但由于牲畜疾病的爆發，以及宗教信仰等原因，豬、牛等來源的膠原蛋白制品的提取和使用受到了限制［1-2］。哺乳動物皮膚膠原的酸溶解性較低，而魚皮中膠原蛋白的酸溶解性相對較高，因此，作為豬、牛等的替代原料，從魚類加工廢棄物魚皮、魚鱗和魚骨等中提取酸溶性膠原蛋白，越來越受到人們的重視［3-5］。

我國是世界上最大的淡水魚養殖國，而湖北作為全國淡水魚生產第一大省，2014年湖北省全年水產品總量433.3萬t，連續19年居全國第一，水產業已成為湖北省農業的一個重要支柱。湖北主要養殖淡水魚品種包括青魚、草魚、鰱魚和鳙魚等。隨著魚類加工業的快速發展，加工過程中產生大量的廢棄物，包括魚皮、魚鱗和魚骨等，約占魚體總重的40%～55%［6］。據報道，魚皮中膠原蛋白含量最高可達80%以上［7-9］，因此從魚皮中提取膠原蛋白不僅能夠充分利用資源，提高魚類加工的附加值，而且可以減少環境污染，對促進魚類加工業的發展具有重要意義。

目前，國內外對鰱魚加工下腳料的研究主要集中在魚鱗的深加工，對魚皮的研究較少［10-12］。因此，本研究以鰱魚魚皮為原料，在低于膠原蛋白變性溫度的條件下進行酸溶性膠原蛋白的提取，研究原料魚皮中酸溶性膠原蛋白提取的最佳工藝條件，并對其熱變性溫度進行測定，以期為鰱魚魚皮的加工利用提供一些理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鰱魚皮：武漢市白沙洲菜場提供；L-羥脯氨酸標準品：Sigma公司；無水Na2CO3、氯胺T、對二甲氨基苯甲醛、NaOH、無水乙醚、乙酸、正丁醇、氯化鈉、鹽酸、檸檬酸等：均為國產分析純。

1.2儀器與設備

SE602F型電子分析天平：奧豪斯儀器有限公司；T6型紫外分光光度計：北京普析儀器有限公司；HHS22型數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LD5-2B型臺式低速離心機：北京京立離心機有限公司；FE20型酸度計：梅特普-托利多儀器有限公司；AR-500動態流變儀：美國TA公司。

1.3方法

1.3.1鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的制備工藝路線

1.3.1.1工藝流程

魚皮→脫雜蛋白→瀝干后用水充分洗滌瀝干→脫脂→瀝干后用水充分洗滌瀝干→加酸溶解→過濾分離濾液和殘渣→濾液鹽析→離心分離→乙酸復溶→透析→凍干→酸溶性膠原蛋白

1.3.1.2操作要點

魚皮洗凈表面雜質和黑色素，瀝干后剪碎，以0.6 mol/L的Na2CO3溶液為雜蛋白脫除試劑，在25℃下處理2次，每次6 h進行脫雜蛋白處理；采用無水乙醚作為脫脂試劑，在料液比為1∶80（g/mL）下處理16 h進行脫脂處理。脫雜后的魚皮用酸溶液溶解，在一定的溫度下浸提，浸提結束后過濾，棄去濾渣，將收集起來的濾液加入氯化鈉鹽析，使氯化鈉終濃度達2.6 mol/L，鹽析時間為14 h。鹽析后的溶液以5 000 r/min的速度離心20 min，棄去上清液，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，轉入透析袋以高純水透析，至無氯離子檢出。倒出透析袋中的膠原蛋白溶液，冷凍干燥后，得到酸溶性膠原蛋白產品。

1.3.2魚皮原料及提取液中羥脯氨酸含量的測定方法

膠原蛋白中的羥脯氨酸在其他蛋白中很少見，可視為膠原蛋白所特有的，因此，通過測定膠原蛋白中羥脯氨酸的含量，可以間接評價膠原蛋白的提取效果。

1.3.2.1羥脯氨酸的測定方法

L-羥脯氨酸經氯胺T氧化后，與對二甲氨基苯甲醛反應生成紅色化合物，在波長558 nm處測定吸光度并與標準比較，可定量羥脯氨酸的含量。

取4.0 mL L-羥脯氨酸標準液于25 mL比色管中，加入2.0 mL氯胺T溶液，混勻后于室溫下放置20 min。取4.0 mL水于25 mL比色管中，與標準液同步試驗，可得空白。加入2.0 mL對二甲氨基苯甲醛與高氯酸按比例配制而成的顯色劑，充分混勻后，迅速將比色管放入60℃水浴中加熱20 min后取出比色管，用冰水冷卻比色管3 min，然后在室溫下放置30 min。用空白管作參比，在波長558 nm處以紫外分光光度計測定其吸光度值。以標準液的吸光度值為縱坐標，相對應的量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2.2魚皮中羥脯氨酸提取率的計算

取1 g魚皮剪碎，放入100 mL具塞比色管中，加入30 mL 3 mol/L的硫酸溶液，并蓋上塞子，置于恒溫干燥箱中，105℃水解6 h。趁熱將水解產物用濾紙過濾至250 mL容量瓶中，用10 mL硫酸溶液分3次洗滌比色管或三角燒瓶和濾紙，濾干后，用10 mL水洗滌濾紙，合并上述溶液。用移液管移取10 mL該水解液至100 mL容量瓶中，加水50 mL，用氫氧化鈉溶液將pH調至中性再用水定容至刻度，所得溶液為待測液。取4.0 mL處理好的待測液于25 mL比色管中，按照1.3.2.1的方法測定魚皮原料中的羥脯氨酸含量。

魚皮原料進行膠原蛋白提取后，按照上述方法測定提取液中的羥脯氨酸含量，按照式1計算羥脯氨酸提取率。

羥脯氨酸提取率/%=

1.3.3鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取工藝研究的單因素試驗

1.3.3.1提取劑種類對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預處理后的鰱魚皮3份，經脫雜蛋白處理和脫脂處理后，分別加入0.5 mol/L的鹽酸、乙酸、檸檬酸80 mL，在一定的溫度下浸提72 h。浸提結束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計算膠原蛋白的提取率。

1.3.3.2提取劑濃度對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預處理后的鰱魚皮4份，經脫雜蛋白處理和脫脂處理后，以乙酸為提取劑，分別調節乙酸濃度為0.3、0.5、0.7、0.9mol/L，料液比1∶80（g/mL），在4℃下浸提24h。浸提結束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計算膠原蛋白的提取率。

1.3.3.3提取時間對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預處理后的鰱魚皮4份，經脫雜蛋白處理和脫脂處理后，以0.5 mol/L乙酸為提取劑，料液比為1∶80 （g/mL），在4℃下分別浸提24、48、72、96 h。浸提結束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計算膠原蛋白的提取率。

1.3.3.4料液比對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預處理后的鰱魚皮4份，經脫雜蛋白處理和脫脂處理后，以0.5 mol/L乙酸為提取劑，調節料液比分別為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL），在4℃下浸提72 h。浸提結束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計算膠原蛋白的提取率。

1.3.4鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取工藝研究的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取劑濃度、提取時間、料液比為考察因素，以魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率為指標，選擇L9（34）正交表進行正交試驗，試驗因素水平表見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1　Orthogonal factor level table

1.3.5鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度測定

用去離子水配制0.6%濃度的酸溶性膠原蛋白水溶液，用AR-500動態流變儀分析溫度對膠原蛋白影響的趨勢，測定膠原蛋白的熱變性溫度。

2　結果與分析

2.1魚皮原料及提取液中羥脯氨酸含量測定的標準曲線

通過比色法，用空白作參照，在波長為558 nm處以紫外分光光度計測定出膠原蛋白中特有的羥脯氨酸含量的方法，來間接評價膠原蛋白的提取效果。用1.3.2的方法，繪制出羥脯氨酸含量的標準曲線如圖1所示。

圖1　羥脯氨酸含量的標準曲線Fig.1　The standard curve of hydroxyproline content

測定標準曲線為y=0.146x+0.013，式中：x為羥脯氨酸質量濃度（μg/mL）；y為558 nm處吸光度。R2= 0.987。

2.2鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取工藝優化的單因素試驗結果

2.2.1提取劑種類對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

提取劑種類對膠原蛋白提取率的影響試驗結果如圖2所示。

圖2　提取劑種類對膠原蛋白提取率的影響Fig.2　Effect of extracting agent types on collagen extraction rate

從圖2可以看出，在其他條件相同的情況下，乙酸對魚皮膠原蛋白的提取最高，提取率可達61.65%；鹽酸次之，提取率為44.06%；檸檬酸的提取率最低，為19.45%。因此，選擇乙酸作為鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取的最佳提取劑。

2.2.2提取劑濃度對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

提取劑濃度對膠原蛋白提取率的影響試驗結果如圖3所示。

圖3　提取劑濃度對膠原蛋白提取率的影響Fig.3　Effect of extracting agent concentration on collagen extraction rate

從圖3中可看出，當乙酸濃度在0.5 mol/L以下時，魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率隨著乙酸濃度的增大而增大，當乙酸濃度為0.5 mol/L時，魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率最高。當乙酸濃度繼續增大時，膠原蛋白的提取率反而下降，因此，選擇乙酸濃度為0.5 mol/L。

2.2.3提取時間對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

提取時間對膠原蛋白提取率的影響試驗結果如圖4所示。

圖4　提取時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.4　Effect of extracting time on collagen extraction rate

由圖4可知，隨著提取時間的增加，魚皮中膠原蛋白的提取率逐漸增大，說明魚皮中的膠原蛋白需要一定的時間才能被提取劑浸提出來。但當浸提時間超過72 h后，膠原蛋白提取率的增加變緩，可能是由于提取劑的提取能力已經達到飽和，考慮到節約提取成本，因此，選擇最佳提取時間為72 h。

2.2.4料液比對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

料液比對膠原蛋白提取率的影響試驗結果如圖5所示。

圖5　料液比對魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on collagen extraction rate

從圖5可知，料液比分別為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）時，魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率分別為58.07%、61.65%、62.05%、62.68%，即料液比為1∶60（g/mL）時魚皮膠原蛋白的提取率最高。可能是由于提取劑用量較少時，魚皮原料與提取劑未能充分接觸，影響了提取效果，當料液比逐漸降低，即提取劑用量逐漸增大時，膠原蛋白的提取率也隨之增大，但當料液比從1∶60（g/mL）降低到1∶70（g/mL）后，提取率的增加變緩，考慮到節約試劑，因此，選擇最佳料液比為1∶60（g/mL）。

2.3酸溶性魚皮膠原蛋白提取工藝優化的正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以乙酸濃度、提取時間、料液比為考察因素，以魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率為指標，選擇L9（34）正交表進行正交試驗，正交試驗結果表見表2，方差分析表見表3。

由表2和表3可知，各因素對鰱魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響重要程度依次是乙酸濃度＞提取時間＞料液比，其中乙酸濃度、提取時間對膠原蛋白的提取率都有非常顯著的影響，料液比對膠原蛋白提取率的影響很小。最優方案為A2B3C1，即料液比1∶60 （g/mL），提取時間96 h，乙酸濃度0.3 mol/L。

表2　正交試驗結果表Table 2　Results of orthogonal experiment

表3方差分析表Table 3　Analysis on variance about orthogonal experiment

取預處理后的鰱魚皮，加入0.3 mol/L乙酸溶液進行提取，調節料液比為1∶60（g/mL），浸提96 h，在此條件下對鰱魚皮中的酸溶性膠原蛋白進行提取，提取率為76.23%，高于正交試驗中所有工藝參數組合下的提取率，證明了正交試驗的正確性。

2.4鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度

用去離子水配制0.6%濃度的酸溶性膠原蛋白水溶液，用AR-500動態流變儀分析溫度對膠原蛋白影響的趨勢，測定得到鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性起始溫度為32.31℃，峰值溫度為34.82℃，因此，在提取過程中應該將溫度控制在32.31℃以下。

3　結論

鰱魚魚皮原料中酸溶性膠原蛋白提取的最佳工藝條件為：以乙酸作為提取劑，乙酸濃度0.3 mol/L，料液比1∶60（g/mL），提取時間96 h；此膠原蛋白的熱變性起始溫度為32.31℃，峰值溫度為34.82℃。

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Study on Extraction of Acid-Soluble Collagens from Silver Carp Skin

HUANG Ai-ni1，WANG Hai-bo2，LI Li1，HU Xiao-hong1，ZHOU Sheng-nan1
（1.College of Food Engineering，Wuchang Institute of Technology，Wuhan 430065，Hubei，China；2.College of Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

With silver carp fish skin as raw material，the optimal extraction parameters of acid-soluble collagens were explored by single factor test and orthogonal test.The denaturation temperatures of acid-soluble collagens were analyzed by AR-500 dynamic rheometer.The results showed that the optimal parameters for the extraction of acid-soluble collagens from silver carp skin were with acetate as the extraction agent，the concentration of acetic acid 0.3 mol/L，material/liquid ratio of 1∶60（g/mL）for 96 h.The starting denaturation temperature of acid-soluble collagens from silver carp skin was 32.31℃，and the peak temperature was 34.82℃.

silver carp skin；acid-soluble collagens；extraction

2015-10-13

湖北省教育廳科學研究計劃項目（B2014127）

黃愛妮（1985—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品新資源開發與利用。