3種食源性致病菌的實時熒光PCR快速檢測

霍勝楠，孟靜，楊振東，鄭世超，張然（.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南500；.江南大學食品學院，江蘇無錫4）

3種食源性致病菌的實時熒光PCR快速檢測

霍勝楠1，孟靜1，楊振東2，鄭世超1，張然1
（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

DNA提取方法采用先鋼珠機械破壞細菌細胞壁，再添加丙酮、蛋白酶K溶解去除雜質，大大提高了食源性致病菌基因組DNA的得率和純度。繼而針對金黃色葡萄球菌egc基因、沙門氏菌NA（not availabale）基因、志賀氏菌ipaH基因為靶基因設計特異性引物對樣品建立實時熒光定量PCR檢測方法。結果試驗設計的引物對3種細菌具有很強特異性，除目標細菌外，對單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌3種對照菌均未檢測到熒光信號。對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的檢測靈敏度分別達到10-6、10-6、10-7ng/μL。

食源性致病菌；基因組DNA提取；實時熒光定量PCR

食源性致病菌主要引起食源性疾病，對人類健康造成極大的傷害，是食品安全的重大隱患。已報道的食源性致病菌已經超過250種［1］，沙門氏菌［2］、金黃色葡萄球菌［3］、志賀氏菌［4］等都是肆虐流行的重要食源性致病菌。食源性致病菌的檢測技術是食源性疾病與控制的關鍵環節。目前包括中國在內的許多國家對這些致病菌的檢驗大多仍沿用傳統的細菌培養及生化鑒定方法，其檢驗周期長、操作繁瑣、靈敏度低，很難適應公共衛生事件應急處理快速反應的需要［5］。實時定量熒光PCR能克服以上缺點，檢測在一個密閉環境中進行，無污染和后處理風險，可以快速、準確檢測目標核酸，達到定量檢測食品中致病菌的目的［6］。

另外，在食品樣品檢測中，經常會遇到致病菌含量低、食品基質復雜等問題，而以PCR為基礎的分子生物學技術對核酸提取的要求既要純度高又要回收率高，目前單純的商品試劑盒提取很難滿足這種要求［7］。核酸提取的關鍵在于組織細胞的裂解和核酸純化，本文采用鋼珠破碎結合生化試劑溶解細胞壁方式增加細菌細胞裂解，大大提高了核酸的提取效率，減少了由于細胞破碎不徹底帶來的檢測失誤，是實際樣品DNA提取操作的必然之選。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

細菌增殖培養液LB肉湯、營養瓊脂（NA）：購自北京陸橋技術有限責任公司；蛋白酶K：購自寶生物工程（大連）有限公司；丙酮、無水乙醇等試劑均為分析純：購自上海國藥公司；細菌基因組DNA提取試劑盒：購自德國Qiagen公司。

1.1.2菌種選擇及生化鑒定

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC-21493）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）：均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。將試驗菌株在NA瓊脂上進行分離培養，根據GB 4789系列食品安全國家標準對活化菌株進行鏡檢及相應生理生化鑒定。挑取陽性單菌落接種至LB肉湯中培養過夜備用。

1.2主要儀器

NanoDrop 2000紫外可見分光光度計：美國Thermo公司；7500 FAST實時熒光PCR儀：美國ABI公司；5424R小型冷凍離心機：德國Eppendorf公司；核酸提取用鋼珠：美國BIOSPEC公司產品。

1.3基因組DNA提取方法

細菌總DNA提取方法參照Qiagen公司細菌核酸提取試劑盒。但在金黃色葡萄球菌細胞破碎時分別采用蛋白酶K酶解、丙酮溶解、丙酮/酶解、鋼珠/丙酮/酶解、丙酮/鋼珠/酶解方法。

1.4擴增引物探針的設計與合成

選取金黃色葡萄球菌egc基因、沙門氏菌NA（not availabale）基因、志賀氏菌ipaH基因作為選擇特異性基因，首先在Genbank中獲得上述3種基因的基因序列，然后利用分子生物學軟件進行引物設計。各檢測基因的引物、探針序列如表1所示。均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1實時熒光PCR檢測引物、探針Table 1　Specific primers and probes sequences in RT-PCR

1.5實時熒光PCR方法分析

PCR反應體系為25 μL，各組分分別為：2×TaKaRa TaqTMBuffer 12.5 μL，引物 Primer-F和Primer-R（10 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，DNA模板1 μL，加蒸餾水補至25 μL。PCR反應條件為：95°C變性10 s，95°C退火5 s，60°C延伸40 s，經40個循環。試驗結果應用ABI 7500FAST Software v2.0.1進行分析處理。判定CT值小于35的擴增結果為致病菌檢測陽性結果。

2　結果與分析

2.1試驗菌株的生理生化確認

試驗菌株在NA上進行分離培養，接種至顯色培養基，利用GB 4789系列食品安全國家標準方法對試驗菌株進行鏡檢及相應生理生化鑒定。通過與鑒定表比對，試驗菌株均符合相應均屬特征，可作為驗證試驗用菌株。

2.2細菌基因組DNA的提取及純度檢測

在金黃色葡萄球菌基因組DNA提取過程中，單純酶解或丙酮處理對于DNA的濃度和純度無顯著影響（表2）。當結合鋼珠破碎細胞壁步驟后，核酸的得率顯著提高，約為單純丙酮酶解得率的2.5倍。而鋼珠破碎步驟與酶解和丙酮處理步驟的先后順序對核酸得率無顯著影響。本試驗在細胞破壁釋放DNA步驟中，先鋼珠機械破壁，再添加丙酮溶脂、蛋白酶K處理的方法具有較高的DNA提取效率，所得DNA濃度大于100 ng/μL，A260/A280值在1.8～2.0之間，DNA純度高，且經濟實惠以及有效防止由于鋼珠告訴振動可能造成的有機溶劑泄露，可以滿足下一步實時熒光PCR反應的準確性要求。

2.3實時熒光PCR擴增體系的引物特異性驗證

針對3種選定菌株，選用單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌作為對照菌株，分別用3種引物進行擴增反應，見圖1。結果顯示，目標菌株均在35個循環內發生顯著擴增，而對照菌株均無顯著性檢測信號，亦沒有出現非特異性擴增信號，表明設計的3對引物特異性好，識別度高，無干擾現象。

2.4實時熒光PCR擴增體系的靈敏度分析

以無菌操作將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌基因組DNA做模板，按10倍遞增逐級稀釋，自100 ng/μL濃度稀釋至10-7ng/μL分別做靈敏度測試。PCR結果如圖2所示。3種致病菌基因組DNA濃度從100 ng/μL到10-7ng/μL使用本文所建立的PCR方法均可在40個循環內出現顯著擴增。一般認為當Ct值小于35時可判斷PCR結果為陽性。當細菌DNA模板濃度稀釋至10-6ng/μL時，金黃色葡萄球菌的檢測仍可為陽性；當細菌DNA模板濃度稀釋至10-5ng/μL，沙門氏菌和志賀氏菌的檢測仍然為陽性。

表2　不同核酸釋放步驟在金黃色葡萄球菌基因組DNA提取效果比較Table 2　Comparison of different nucleic acid release steps in Staphylococcus aureus genomic DNA extraction effect

圖1實時熒光PCR特異性檢測結果圖Fig.1　Real-time fluorescence quantitative specificity curve of 3 pathogens

圖23種細菌的實時熒光定量PCR靈敏度擴增曲線（常態型）Fig.2　Real-time fluorescence quantitative amplification detection limit curve of 3 pathogens（Normal view）

2.5標準曲線的建立以及線性檢測范圍

以10倍梯度稀釋細菌DNA模板進行實時熒光PCR定量檢測。試驗得出的常態型擴增曲線（圖2）顯示：總體上所有曲線的拐點清楚，指數增長期明顯，基線平穩無上揚現象，低濃度樣本擴增曲線指數明顯，一方面說明靈敏度高，另一方面不易出現假陽性、假陰性的誤判；曲線指數期斜率大，表明擴增效率高，實際靈敏度、引物和探針效果好；擴增曲線的整體平行性好，相鄰濃度標準品擴增曲線與曲線之間的間距都十分接近，是擴增效率都搞的反應。且圖2中，基線起峰范圍適當，各檢測結果都在12～35之間，保證了定量的準確性。

以DNA模板濃度對數為橫坐標，CT值為縱坐標建立本研究RT-PCR方法的標準曲線（圖3）。金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的檢測線性范圍可以達到8個數量級，志賀氏菌的檢測線性范圍可以達到9個數量級。CT值和起始模板濃度的相關性好，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的標準曲線線性相關性可以達到0.999以上，而志賀氏菌的標準曲線線性略差，也達到0.99以上，3種細菌的標準曲線均接近理想值。

圖3　3種細菌的實時熒光定量PCR標準曲線Fig.3　Real-time fluorescence quantitative standard curve of 3 pathogens

3　討論

高質量的基因組DNA是進行基因檢測和研究的前提。近年來隨著分子生物學技術在食品檢測方面的廣泛應用，世界各大實驗室都積極致力于更加經濟實用效率更高的DNA提取方法。Ramos-Gomez［8］等利用CATB方法提取橄欖油、葵花籽油等多種蔬菜油產品中的DNA，其提取產物純度和數量都可滿足后續q-PCR檢測的需要。為檢測生豬肉中的沙門氏菌，Lofstrom等研究利用核酸吸附柱提取商品肉中的細菌核酸，并比較實時熒光定量PCR方法與非PCR方法，結果顯示實時熒光定量PCR比非PCR方法靈敏度更高特異性更強［9］。Sowmya［10］等利用1%的表面活性劑Triton X-100去除食品樣品中的雜質，有效提取牛奶、甘蔗汁和米飯中的金黃色葡萄球菌基因組DNA。但此方法僅適用于選定樣品的加標樣核酸提取，其他樣品推廣仍待考究。研究發現，普通細菌基因組DNA提取方法針對腸桿菌科的革蘭氏陰性桿菌都有較高的提取效率，但對含芽孢的細菌及金黃色葡球菌、單核細胞增生李斯特氏菌等革蘭氏陽性菌的提取效率較低。其主要原因在于革蘭氏陽性球菌細胞壁較厚，傳統的DNA釋放方法熱裂解法、酶解法、SDS法、酚/氯仿提取法不能高效的溶解破壞細胞壁，從而導致DNA量少雜質多。為了尋求一種高效的細菌基因組DNA提取方法，提取高質量的細菌基因組DNA，獲得更準確的PCR結果，綜合各種研究方法的利弊，本研究建立的改良細菌基因組DNA提取方法，在細菌破壁、DNA釋放步驟中，通過加入丙酮處理，破壞細胞壁脂質結構，結合鋼珠振蕩處理機械力與蛋白酶K消化，增強了細胞壁的通透性，促進了DNA的釋放。本方法適用于革蘭氏陰性細菌及革蘭氏陽性細菌基因組DNA的高效提取，較傳統核酸提取方法，所提取的基因組DNA濃度、純度高，可以滿足RT-PCR和PCR-RELP對DNA模板高質量的要求。

按照我國食品安全國家標準要求，加工食品中，肉制品、乳制品、飲料等金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌是必檢項目，不得檢出，上述3種致病菌的快速檢測方法開發也成為食品安全檢測中的研究熱點。本研究選擇金黃色葡萄球菌egc、沙門氏菌NA（not available）、志賀氏菌ipaH基因，設計試時熒光PCR方法特異引物和TaqMan探針。經NCBI序列比對，用于實時熒光PCR檢測的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌特異序列均與同屬內病原菌有較高的相似性（＞93%）。Goto［11］等利用特異性引物采用RT-PCR方法當牛奶樣品中金黃色葡萄球菌DNA濃度達到50 ng～50 pg即可準確的檢出金黃色葡萄球菌。另一篇報道中Chiang等采用熱激蛋白htrA設計新型特異性引物，可以檢測到牛奶和肉中最低1 CFU/mL的金黃色葡萄球菌［12］。同樣采用實時熒光定量PCR方法，有研究顯示可在多種食品中檢出多種沙門氏菌，最低檢測限可達到0.2 CFU/ mL～2.0 CFU/mL［2］。對于志賀氏菌的檢測通常都與金黃色葡萄球菌和沙門氏菌同時進行。有報道顯示利用RT-PCR方法，對樣品采取先細菌增生再檢測的處理，可以檢測最低1 CFU/10 g濃度的志賀氏菌，并且這種檢測與普通的生化檢測結果沒有顯著性差異［13］。同其他PCR檢查方法相比，本試驗的靈敏度更低，檢測準確性更高。本研究為食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌的快速鑒定探索了有效的檢測方法。

4　結論

綜上所述，本試驗建立的實時熒光PCR檢測方法，檢測范圍寬、靈敏度高，初始細菌DNA模板的濃度可以低至10-5和10-6數量級，是一種穩定性、精確度、特異性好的檢測方法。該方法可準確應用于各種材料食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的檢測，為控制食源性致病菌污染提供有效手段。

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Rapid Detection Using Real Time-PCR for Three Foodborne Pathogens

HUO Sheng-nan1，MENG Jing1，YANG Zhen-dong2，ZHENG Shi-chao1，ZHANG Ran1
（1.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，Shandong，China；2.The School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The genome DNA of Staphylococcus aureus was extracted by four different method and finally chose a method combined steel ball destruction and acetone，protease K removing impurities to get high purity and output DNA.Then the protein gene（egc）of Staphylococcus aureus，a NA gene of Salmonella，and ipaH gene （iapH）of Shigella were used as the gene targets.And the samples were determined by real-time PCR technique.The results showed that the primers were highly specific.No fluorescence signal was determined in other 3 control pathogens（Listeria monocytogenes，Vibrio parahaemolyticus and Bacillus cereus）but target bacteria. The RT-PCR assay could be specific and rapid，and the detection limits were 10-6，10-6，10-7ng/μL.

foodborne pathogens；DNA extraction；real-time polymerase chain reaction

2016-05-06

霍勝楠（1980—），女（漢），高級工程師，博士研究生，研究方向為食品生物安全風險監測及技術開發。