ATP在Aβ1-42導致的突觸可塑性損害中的作用

周治平，　鄭　戈，　賴玉潔，　王年臻，　楊國帥，　王愛岳，　余　丹

?

ATP在Aβ1-42導致的突觸可塑性損害中的作用

周治平1，鄭戈2，賴玉潔1，王年臻1，楊國帥1，王愛岳1，余丹1

目的探討ATP在調節神經元突觸可塑性中的作用。方法培養大鼠原代神經元細胞，應用Aβ1-42孵育原代培養的神經元細胞48 h，或者在Aβ1-42孵育原代培養的神經元細胞前30 min預先給予ATP處理細胞。應用Alexa Fluor 488-phalloidin dye染色觀察不同處理后神經元樹突棘的變化。同時，應用Western blot檢測Aβ1-42及ATP處理后對PDS-95蛋白表達的影響。結果ATP能減少Aβ1-42所導致的神經元樹突棘丟失，Aβ1-42孵育原代培養的神經元細胞48 h后，PSD-95蛋白水平降低；而經過ATP預處理30 min后，神經元PSD-95蛋白表達無顯著變化。結論ATP能夠調節神經元突觸可塑性，從而發揮腦保護作用。

膠質遞質；β淀粉樣蛋白；突觸可塑性

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進行性神經系統退行性變，也是最常見的一種癡呆類型，其主要的病理特征包括老年斑、神經原纖維纏結和神經元死亡[1]。老年斑是由β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)沉積形成；Aβ的過度產生是AD發病的關鍵環節[2]。研究發現，神經元能夠釋放神經遞質以主動響應外界的刺激。這些遞質包括谷氨酰胺、ATP、D-serine等小分子[3]。

谷氨酰胺、D-serine能通過多種途徑參與神經元突觸可塑性調節已經被證實[4，5]。同樣的，研究發現ATP通過激活嘌呤受體增加突觸后興奮性電流EPSCs的幅值，但在海馬GABA能神經元突觸釋放中卻起抑制作用[6]。這些研究結果提示，神經元可能通過釋放不同的神經遞質來參與神經元興奮性的調節，并且同一種神經遞質可能在不同神經元種類或突觸中發揮不同的作用[7,8]。然而，目前對ATP在阿爾茨海默病突觸功能障礙中作用機制的研究還遠不及谷氨酰胺、D-serine等深入，但ATP產生障礙或不足所造成的損害作用是肯定的。因此，本實驗在原代培養的神經元內觀察，補充ATP后對Aβ1-42導致的突觸功能障礙的影響，旨在探討神經遞質ATP參與AD突觸功能障礙的分子機制，為AD的治療尋找新的靶點。

1　實驗材料

1.1實驗動物SPF級清潔SD孕鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝)2012-0001]。從孕18 d的SD母鼠子宮內取胎鼠，雌雄不限。從胎鼠腦內提取海馬神經元進行體外培養。

1.2實驗試劑(1)Aβ1-42、MgATP、多聚賴氨酸均購自美國Sigma公司；(2)Neurabasal培養基、DMEM-F12 培養液、B27、胎牛血清均是Gibco公司產品。L-谷氨酰胺購自碧云天生物技術公司；(3)一抗：小鼠抗大鼠anti-PSD95 (santa，sc-32290)；二抗：堿性磷酸酯酶標記山羊抗小鼠IgG (H+L)(碧云天，A0258)、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天，P0012A)、BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，C3206)等。

1.3主要溶液配制種植液的配方：EMDM培養液90 ml、10%胎牛血清10 ml、 谷氨酰胺100 μl 、雙抗100 μg(1 μg/ml)；培養液的配方：Neurobasal培養基98 ml、1%B27 2 ml、谷氨酰胺100 μl、雙抗100 μg(1 μg/ml)。

2　實驗方法

2.1大鼠原代海馬神經元細胞培養SD孕鼠腹腔注射麻醉后，開腹取子宮獲取胎鼠，無菌條件下，斷頭至75%乙醇消毒，PBS清洗后開顱分離胎鼠腦皮質。將分離出的大腦皮質置于無鈣鎂的D-hanks溶液中，將大腦皮質剪碎，并加入0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液孵箱內進行消化15 min。消化完成后，將胰酶吸盡，加入含10%胎牛血清的種植液(DMED)終止消化。用巴氏吸管進行吹打，然后用400目的網篩過濾，取細胞懸液進行離心，以800 rpm離心5 min，留取沉淀物。將沉淀物用種植液進行重懸。以5×105/ml接種到準備好的多聚賴氨酸包被的六孔板內，置于37 ℃，5%CO2室溫培養箱里進行培養。種植24 h后，給予全量換液，此后間隔1 d進行半量換液。培養至7 d～9 d時給予相應的處理，收集細胞勻漿后進行免疫印跡檢測相應指標。

2.2細胞總蛋白提取(1)經干預處理后的細胞，置于冰板上，吸盡培養基，用預冷的PBS漂洗兩次，每次2 min，加入蛋白裂解液60 μl/孔裂解細胞，用細胞刮快速刮取每組細胞，用標記好的EP管收集各組細胞；(2)收集的各組細胞裂解液置于冰上，每5 min震蕩一次，重復3次后放入4 ℃離心機，14000 rpm，15 min，吸取上清至新的標記好的EP管；(3)留取一部分測蛋白濃度，剩余部分加入上樣緩沖液(loading buffer)后放入水浴鍋中煮沸5 min，-80 ℃冰箱保存。

2.3蛋白質印跡法(Western blot)細胞蛋白提取液混合5×蛋白上樣緩沖液。煮沸5 min，上樣。等量的蛋白樣品經8%的SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉法電轉移至PVDF 膜上，再經5%BSA 封閉1 h后，加入適量稀釋的一抗(1∶1000)，4 ℃過夜。用洗滌液(washing buffer)洗膜3遍，換入相應的二抗(1∶4000)，室溫孵育1 h，洗膜3遍，以BCIP/NBT顯色，并且進行分析。

2.4海馬CA1神經元圖像采集及樹突棘的形態定量分析采用LSM510 META激光掃描共聚焦顯微鏡(德國蔡司)掃描拍攝海馬CA1錐體細胞,掃描拍攝圖像經過Neurolucida軟件繪制重塑神經元的結構,并用Neuro Explorer軟件分別統計出二級樹突的樹突棘的密度。

3　結　果

3.1ATP能減少Aβ1-42所導致的神經元樹突棘丟失Aβ1-42孵育原代培養的神經元細胞48 h，或者在Aβ1-42孵育原代培養的神經元細胞前30 min預先給予ATP處理細胞。應用Alexa Fluor 488-phalloidin dye染色觀察不同處理后神經元樹突棘的變化。經Aβ1-42孵育后神經元樹突棘顯著減少，而經過ATP預處理后的神經元樹突棘則無顯著變化(P=0.033,對照組 vs Aβ1-42；P=0.870，對照組 vs Aβ1-42+ATP；P=0.870,對照組 vs ATP,見表1)。

3.2ATP能拮抗Aβ1-42所導致的神經元突觸蛋白PSD-95的表達減少Aβ1-42孵育原代培養的神經元細胞48 h后，PSD-95蛋白表達水平降低；而經過ATP預處理30 min后的神經元PSD-95蛋白表達水平無顯著變化(P<0.001,對照組 vs Aβ1-42；P=0.509，對照組 vs Aβ1-42+ATP；P=0.835,對照組 vs ATP，見表2)。

表1　各組熒光強度值比較±s)

表2　各組蛋白印跡灰度值的比較±s)

4　討　論

我們的實驗結果顯示，神經遞質ATP能夠抑制Aβ1-42所導致的突觸功能障礙。首先，我們在原代培養的大鼠神經元里證實ATP能夠拮抗導致的神經元樹突棘缺失。進一步研究發現，ATP不僅能改善Aβ1-42導致的突觸形態學改變，還能逆轉Aβ1-42所導致的突觸蛋白PSD-95的減少。這些結果表明ATP能夠拮抗Aβ1-42對神經突觸可塑性的影響而發揮腦保護作用。

在中樞神經系統中，ATP作為神經遞質對神經元的興奮作用是普遍存在的[9]。突觸間隙中存在著ATP的特異性水解酶(ATP酶)和腺苷三磷酸雙磷酸酶。釋放到突觸間隙的ATP及其代謝產物具有信息傳遞的作用。在外周，ATP可使神經元產生快速的興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)[10]。Nakazawa等報道，在大鼠交感神經元和神經肌肉接頭處ATP不僅能直接激活膽堿能受體使離子通道自發性開發活動的次數提高10倍，還能使其受體通道開放的次數明顯增加[11]。

為了進一步研究單純ATP對神經元的影響，同時避免其他神經遞質如谷氨酰胺、細胞因子的影響。我們應用ATP直接處理原代培養的神經細胞，我們觀察到應用ATP預處理神經元30 min能夠有效逆轉Aβ1-42導致的神經元樹突棘及突觸蛋白PSD-95的減少。PSD-95是突觸后致密物質中的一種特殊蛋白，它能夠介導蛋白質間的相互作用[12]。PSD-95在突觸上的數量變化是突觸功能活動的重要結構基礎[13]。研究表明，敲除PSD-95基因可引起小鼠長時程增強(LTP)的改變和學習記憶功能障礙[14]。目前，LTP已被普遍認為是學習記憶鞏固過程中神經元生理活動的客觀指標，反映了突觸水平上的信息儲存過程[15]。在我們的實驗中，我們觀察到Aβ1-42能夠影響神經元突觸可塑性，這表現在樹突棘數量及突觸蛋白PSD-95的減少。而ATP能夠抑制Aβ1-42對神經元突觸可塑性的影響，表現在補充ATP后神經元樹突棘數量及突觸蛋白PSD-95的表達增加。在神經元樹突棘上,ATP及其偶聯的信號轉導通路,通過各種支架蛋白形成突觸后致密區(PSD),它含有幾百種蛋白質。這種復雜而精巧的棘突結構,是接收突觸前信號并進行生化加工的獨立單元。樹突棘能對接收的大量信號進行神經計算和整合,并依據刺激的方式做出反應,使突觸的結構和功能發生相應變化,即形成突觸的可塑性。而突觸可塑性被認為是學習和記憶的分子機制與認知功能相關。

5　結　論

我們的研究發現ATP能夠調節神經元突觸可塑性。在AD中，由于Aβ所導致的樹突棘及突觸蛋白PSD-95的減少能夠被ATP所抑制，從而發揮腦保護作用。因此，有效控制ATP的釋放或糾正ATP生成不足可能成為治療AD的潛在靶點。

[1]Kam K,Duffy AM,Moretto J,et al.Interictal spikes during sleep are an early defect in the Tg2576 mouse model of beta-amyloid neuropathology[J].Scientific Reports,2016,6:201-219.

[2]Diaz M,Fabelo N,Casanas-Sanchez V,et al.Hippocampal lipid homeostasis in APP/PS1 mice is modulated by a complex interplay between dietary DHA and estrogens:relevance for Alzheimer’s disease[J].J Alzheimer’s Dis,2015,49(2):459-481.

[3]Li X,Zhang YY,Chen ZQ,et al.D-serine-induced inactivation of NMDA receptors in cultured rat hippocampal neurons expressing NR2A subunits is Ca2+-dependent[J].CNS Neuroscience & Therapeutics,2014,20(11):951-960.

[4]Natsubori T,Inoue H,Abe O,et al.Reduced frontal glutamate+glutamine and N-acetylaspartate levels in patients with chronic schizophrenia but not in those at clinical high risk for psychosis or with first-episode schizophrenia[J].Schizophrenia Bulletin,2014,40(5):1128-1139.

[5]Han H,Peng Y,Dong Z.D-Serine rescues the deficits of hippocampal long-term potentiation and learning and memory induced by sodium fluoroacetate[J].Pharmacology Biochemistry Behavior,2015,133:51-56.

[6]Khakh BS.ATP-gated P2X receptors on excitatory nerve terminals onto interneurons initiate a form of asynchronous glutamate release[J].Neuropharmacology,2009,56(1):216-222.

[7]Martin ED,Buno W.Stabilizing effects of extracellular ATP on synaptic efficacy and plasticity in hippocampal pyramidal neurons[J].Euro J Neurosci,2005,21(4):936-944.

[8]Willyerd FA,Empey PE,Philbrick A,et al.Expression of ATP-binding cassette transporters B1 and C1 after severe traumatic brain injury in humans[J].J Neurotrauma,2016,33(2):226-231.

[9]Pankratov Y,Lalo U,Verkhratsky A,et al.Vesicular release of ATP at central synapses[J].Euro J Physiol,2006,452(5):589-597.

[10]Suzuki T.Cellular mechanisms in taste buds[J].The Bulletin of Tokyo Dental College,2007,48(4):151-161.

[11]von Kugelgen I,Kurz K,Starke K.Axon terminal P2-purinoceptors in feedback control of sympathetic transmitter release[J].Neuroscience,1993,56(2):263-267.

[12]Sultana R,Banks WA,Butterfield DA.Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory,accumulation of Abeta,and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheime’s disease[J].J Neurosci Res,2010,88(3):469-477.

[13]Greenwood IA.Intricate vascular architecture revealed after removing the scaffolding:PSD95 crucial for vascular Kv1 function[J].J Physiology,2011,589(24):5901.

[14]Huang YN,Tsai RY,Lin SL,et al.Amitriptyline attenuates astrocyte activation and morphine tolerance in rats: role of the PSD-95/NR1/nNOS/PKC gamma signaling pathway[J].Behavioural Brain Res,2012,229(2):401-411.

[15]Rammes G,Gravius A,Ruitenberg M,et al.MRZ-99030-A novel modulator of Abeta aggregation:II-Reversal of Abeta oligomer-induced deficits in long-term potentiation (LTP) and cognitive performance in rats and mice[J].Neuropharmacol,2015,92:170-182.

The effect of ATP on Aβ1-42mediated disruption of synaptic plasticity

ZHOUZhiping,ZHENGGe,LAIYujie,etal.

(DeparmentofNeurology,HaikouPeople’sHospital,Haikou570208,China)

ObjectiveThis study was conducted to investigate the effect of ATP in regulatory on synaptic plasticity.MethodsPrimary neurons were cultured successfully.Neurons were treated with Aβ1-42or ATP.The neuronal spine loss and PSD-95 expression were studied by using immunohistochemistry and Western blotting,respectively.ResultsWe found that exogenous ATP protected Aβ1-42mediated reduction in synaptic molecules,such as PSD-95 and prevented Aβ1-42induced spine reduction in cultured primary hippocampal neurons.ConclusionOur findings suggested that ATP plays a protective role against Aβ1-42mediated disruption of synaptic plasticity.

Neuron；Amyloid-β；Synaptic plasticity

1003-2754(2016)08-0724-03

2016-04-18；

2016-05-29

(1.海口市人民醫院神經內科，海南 海口 570208；2.吉林大學第二醫院肝膽胰外科，吉林 長春 130041)

周治平，E-mail：zzping@yeah.net

R749.1

A