納米級胰島素顆粒的制備和使用

梁華麗（河南省駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000）

納米級胰島素顆粒的制備和使用

梁華麗
（河南省駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000）

目的 通過使用逆相蒸發(fā)法制備胰島素脂質(zhì)體顆粒，對顆粒進(jìn)行殼聚糖外殼包裹并做進(jìn)一步的顆粒粒徑，包封率和穩(wěn)定性的測試。結(jié)果 所制備的胰島素亞微球顆粒粒徑范圍為（451.1±46.1）nm，包封率為61.4%，顆粒在水相和油相溶液中均結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。通過大鼠腸道吸收測試，有效降低血糖濃度。結(jié)論 殼聚糖包裹胰島素脂質(zhì)體包封效果良好，粒徑穩(wěn)定并且能夠口服后有效降低血糖濃度。

納米級胰島素顆粒；糖尿病；口服；穩(wěn)定性

胰島素（insulin）在糖尿病治療中已經(jīng)被使用了非常久的時(shí)間，是一類蛋白質(zhì)多肽類藥物，由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致口服給藥具有一定的困難。其主要原因?yàn)椋孩傧烂傅钠茐暮徒到庾饔茫虎趩渭兊囊葝u素或者制劑難以穿越消化道上皮吸收屏障；③單體的胰島素藥物在體外保存容易受到環(huán)境的影響和破壞。隨著納米生物技術(shù)被引入吸入和口服給藥系統(tǒng)，近年來有大量的文獻(xiàn)報(bào)道如果能將藥物進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌瑒t既可以保護(hù)藥物不受外界環(huán)境的影響，更能借助包裹材料的特殊性促進(jìn)藥物吸收甚至做到靶向給藥的效果。關(guān)于胰島素的納米顆粒制備目前有包括絲素骨架、殼聚糖包裹脂質(zhì)體、氰基丙烯酸酯等多種不同的包裹方法［1-3］。目前較為常用的則是以殼聚糖包裹脂質(zhì)體的制備方式。

1　資料與方法

1.1儀器：JY98-IIIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超細(xì)粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），LGJ-10F方倉壓蓋冷凍干燥機(jī)，U-T6A型紫外可見分光光度計(jì)（上海屹譜儀器制造有限公司），ZS90顆粒粒度測試儀（馬爾文儀器）。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥：胰島素原藥（國藥集團(tuán)），卵磷脂（上海伯奧生物科技有限公司），PVP-K30（江陰嘉豐化工），殼聚糖（鄭州金利生物科技有限公司），膽酸鈉（上海化學(xué)試劑站分裝廠），葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司）。

1.3動物：Waster大鼠（250±15）g，購自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

2　實(shí)驗(yàn)方法和優(yōu)化過程

2.1殼聚糖的制備：將5 g殼聚糖溶解在1%的稀醋酸溶液中400 mL中，過濾，用NH4OH中和滴定濾液直至中性，過濾后反復(fù)洗滌，最后冷凍干燥儲存。

2.2制備脂質(zhì)體混懸液：取胰島素4 mg溶解在0.1 mol/L的鹽酸0.5 mL中，再加入含有PVP-K30的水相介質(zhì)2.5 mL，然后與乙醚進(jìn)行混合，水浴超聲乳化，將所得乳劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)掉有機(jī)容積，最后在進(jìn)行探針式超聲的同時(shí)加入殼聚糖溶液，并在水浴上旋轉(zhuǎn)孵化，得到混懸液。

2.3處方的篩選和優(yōu)化：根據(jù)混懸液中的預(yù)實(shí)驗(yàn)狀況，我們確定膽固醇用量、水相中PVP-K30濃度、殼聚糖濃度、維生素E用量和水相介質(zhì)種類5個(gè)因素為主要考慮因素，通過考察這5個(gè)因素的量以及加入時(shí)間的先后，溫度的調(diào)控，我們得到的結(jié)論為殼聚糖的濃度和水相中PVP-K30的濃度影響較大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從工藝上進(jìn)行考察，我們發(fā)現(xiàn)殼聚糖加入時(shí)的溫度和時(shí)間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。因此通過整個(gè)優(yōu)化，我們定義為制備過程中需要在10 ℃時(shí)優(yōu)先加入殼聚糖并緩慢攪拌然后一次加入PVP-K30、維生素E、膽固醇，然后再緩慢升溫到20 ℃完成顆粒制備包裹。

2.4顆粒粒度測試：通過使用馬爾文ZS90，我們對顆粒的粒度進(jìn)行了3次重復(fù)的測試，結(jié)果證明顆粒的平均粒度范圍為（451.1±46.1）nm。

2.5胰島素顆粒降血糖作用比較：通過給大鼠灌胃我們分別比較了3種不同給藥方式的大鼠降血糖的情況，我們分別采用了直接喂食胰島素、胰島素脂質(zhì)體和殼聚糖包裹的胰島素脂質(zhì)體進(jìn)行對比，記錄了大鼠在服用以后0、1、2、4 h的血糖變化，在整個(gè)對比過程中，我們以0 h為基準(zhǔn)，血糖變化以百分比進(jìn)行計(jì)算，見表1。從表1數(shù)據(jù)上看，我們發(fā)現(xiàn)直接服用胰島素的大鼠并沒有獲得任何有效的降血糖效果，而服用了胰島素脂質(zhì)體和殼聚糖包裹胰島素脂質(zhì)體在1 h和2 h時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的血糖值下降，而殼聚糖包裹的胰島素脂質(zhì)體顆粒效果一直延續(xù)到4 h以后。

表1　大鼠喂食不同種類藥物后6 h內(nèi)降血糖作用

3　討 論

從給藥途徑上講，口服胰島素是最方便快捷的途徑，但是直接口服給藥一直沒有達(dá)到藥理學(xué)上需要的效果，究其原因還是因?yàn)槟c道的蛋白酶會對胰島素的有效結(jié)構(gòu)起到毀滅性的破壞作用，同時(shí)由于小腸上皮細(xì)胞間的屏障作用，使得胰島素的吸收效率更為低下。隨著納米醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)的交叉，人們逐漸注意到一些高分子材料具有良好的親水性、生物適應(yīng)性、生物黏附性和可降解性，并且能夠通過制定好的表面修飾延長在吸收部位的滯留時(shí)間，從而提高生物利用度，更有可以對表面做特殊靶向性修飾的顆粒，可以將藥物輸送到需要部位，同時(shí)，由于需要進(jìn)入人體的消化和循環(huán)系統(tǒng)，對于這些材料的本身也必須兼具易降解、無毒性等特殊的要求［1］。

殼聚糖屬于多糖類物質(zhì)，通過酯鍵聚合成分子量大小不等的聚合物，最主要的特點(diǎn)是具備良好的生物兼容性，并且可以被降解且沒有毒性，因此近年來被廣泛應(yīng)用于人工組織、藥物控制釋放系統(tǒng)等生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。我們利用殼聚糖的特點(diǎn)，制備了殼聚糖包裹帶有胰島素脂質(zhì)體的顆粒，通過實(shí)驗(yàn)證明了所形成的顆粒，粒度大小穩(wěn)定，并且能夠在腸道保留更長的時(shí)間，通過大鼠直接喂食實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)，使用了殼聚糖包裹的脂質(zhì)體胰島素顆粒，其時(shí)效性明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用脂質(zhì)體包裹的胰島素顆粒。同時(shí)，殼聚糖微球可以在一定程度上避免消化道蛋白酶對胰島素的分解作用，同時(shí)可以通過小腸上皮細(xì)胞的payer區(qū)進(jìn)入門脈系統(tǒng)，從而加強(qiáng)胰島素的吸收率。當(dāng)然，殼聚糖只是各種諸多緩釋材料中的一種，隨時(shí)材料科學(xué)的不斷進(jìn)步，更多形式的材料也越來越多的被應(yīng)用到藥物緩釋系統(tǒng)中，如蠶絲絲素蛋白是蠶繭脫膠后的一種生物相容性非常好的材料，并且具有化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)［3］。再如聚氰基丙烯酸丁酯具有較高的生物相容性、器官靶向性、抗菌性和無毒性等多種特點(diǎn)，并且加工制備較為方便，是非常好的包封緩釋材料，其他不同類型的材料還有包括纖維素、玉米醇溶蛋白、二氧化硅等，在包封原理和結(jié)構(gòu)上也各有不同［2］。

從制備方法上，目前主要有逆相蒸發(fā)法和超聲薄膜法這兩種方法，從一些文獻(xiàn)上我們能知道逆相蒸發(fā)法在制備的顆粒上均一性更強(qiáng)，但是顆粒粒徑會略大；而相比之下超聲薄膜法制備的顆粒粒徑明顯更小但是顆粒的分布狀態(tài)略寬。其他方法還有復(fù)乳-溶劑蒸發(fā)法、擠壓法、冷凍干燥法、有機(jī)溶劑分散法、乙醇乙醚蒸發(fā)法和鈣融合法等多種，在此我們不一一做分析和評論［1-3］。

本次研究的結(jié)果表明殼聚糖包裹的胰島素脂質(zhì)體顆粒可以作為口服胰島素的良好載體，同時(shí)可以通過與細(xì)胞膜的相互作用增加大分子在細(xì)胞旁路的通透性，此外，需要注意的是此次制備的顆粒粒徑從分布上來說仍然略微偏大［（451.1±46.1）nm］，從生物利用率和吸收率上來講，顆粒越小，那么被吸收的可能性也會越大，一般認(rèn)為脂質(zhì)體顆粒粒徑在100 nm左右是非常合適的粒度大小，在這個(gè)粒度上小腸黏膜往往可以通過胞吞和胞飲的方式對顆粒進(jìn)行直接吸收并且不改變顆粒原本的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，這對于保護(hù)藥物不受干擾等方面具有非常中藥的作用。因此可以考慮在未來的試驗(yàn)中加強(qiáng)對于顆粒粒度、粒型以及生物利用率上的研究。

［1］ 吳正紅，平其能，魏毅，等.殼聚糖包覆胰島素脂質(zhì)體處方與工藝優(yōu)化［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2003，34（2）：76-80.

［2］ 黃慧，田浩明，李雄偉.殼聚糖胰島素微球在糖尿病大鼠中的降糖作用研究［C］//中華醫(yī)學(xué)會第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會議論文匯編，2001：425-427.

［3］ 董寶軍，王常勇，郭希民，等.口服殼聚糖胰島素納米粒的制備及其降血糖作用研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30（3）：208-210.

R587.1；R977.1+5

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1671-8194（2016）23-0040-02