大鼠肺間質纖維化造模的2種方法比較研究

閆　莉，謝艷華，楊　倩，王四旺*，崔嘉輝，吳讓鑫

(1.第四軍醫大學藥學院天然藥物學教研室，西安　710032;2.第四軍醫大學學員旅，西安　710032)

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大鼠肺間質纖維化造模的2種方法比較研究

閆莉1，謝艷華1，楊倩1，王四旺1*，崔嘉輝2，吳讓鑫2

(1.第四軍醫大學藥學院天然藥物學教研室，西安710032;2.第四軍醫大學學員旅，西安710032)

目的探討氣管和腹腔注射2種給藥方式復制特發性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)大鼠模型的差異。方法240～260g雄性SD大鼠24只，按照隨機數字表法分為氣管對照組(QC組)、氣管給藥組(Q組)、腹腔對照組(FC組)和腹腔給藥組(F組)，每組 6 只。分別經氣管一次性注射生理鹽水0.2mL或博萊霉素(BLM)5mg·kg-1·d-1；腹腔注射生理鹽水0.2mL或博萊霉素15mg·kg-1·d-1，連續10d。28d后處死。觀察每組小鼠生存率、體質量、肺臟外觀、病理改變及肺組織羥脯氨酸含量。結果Q組生存率為66.7%；F組生存率為83.3%，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。2種方法給藥組大鼠體質量均減輕，F組動物體質量在1～7d內下降，第8天起開始恢復；Q組動物體質量在前15d內持續下降，第16d起開始恢復。2種方法給藥組的肺臟外觀基本相同，沒有顯著差別。病理檢查證實，Q組的膠原纖維沉積主要分布在氣管周圍，而F組的膠原沉積則分布在胸膜和肺間質。2種方法復制的模型組肺組織羥脯氨酸含量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組間差異無統計學意義。結論氣管給藥與腹腔給藥對于復制大鼠IPF無明顯差別，但氣管給藥法更方便、經濟和可靠。

博萊霉素；肺間質纖維化；造模

肺纖維化是指在不同因素刺激下引起肺部炎癥反應，肺泡持續損傷，細胞外基質被反復破壞、修復、重建并過度沉積，最終導致正常肺組織結構改變、功能喪失的一類疾病，是所有間質性肺病的終末結局。特發性肺間質纖維化 (Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)中的特發性指發病原因不明，占所有間質性肺病的65%左右，嚴重威脅人類健康，但其確切的發病機制至今尚未明了，臨床上仍缺乏有效的治療手段，病死率高[1-8]。因此，建立肺纖維化大鼠模型，對進一步探索該疾病的發病機制、評價治療新藥具有重要意義。

截至目前，利用博萊霉素(bleomycin，BLM)可致肺纖維化的毒性不良反應，復制嚙齒動物肺纖維化，用來研究IPF，是最普遍和最經典的動物模型[9-14]。常用的給藥方法有：支氣管給藥，腹腔注射和尾靜脈注射。因給藥方法不同，復制IPF的成模率、成本及其病理變化特點尚缺乏統一標準；然而，良好的動物模型是疾病研究和新藥研發的基礎，故本文依據簡便操作和經濟的原則，重點比較研究了腹腔和氣管給予博萊霉素建立肺間質纖維化模型的差異，為進一步探索IPF發病機制和篩查有效治療藥物提供方便、經濟和可靠的動物模型。

1　儀器與材料

1.1儀器電子天平(丹佛儀器公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海啟前電子科技有限公司)；離心沉淀機、小型高速冷凍離心機(賽特湘儀離心機儀器有限公司)；半自動生化儀(西化儀北京科技有限公司)；照相用顯微鏡(日本Oylmpus公司)。

1.2試藥注射用鹽酸博萊霉素(15mg·支-1，日本化藥株式會社，生產批號：730342)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；多聚甲醛(優級純，北京化工廠)；生理鹽水(山東康寧藥業有限公司)；羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒(酸水解法，南京建成生物工程有限公司)；無水乙醇(分析純，北京化工廠)；水為實驗室雙蒸水。

1.3動物健康SD大鼠，雄性，SPF級，體質量240～260g，購自第四軍醫大學動物實驗中心，合格證號：SCXK(陜)2014-002。

2　方法

2.1動物分組24只雄性SD大鼠，購回后寄養于第四軍醫大學藥物研究所藥理實驗室SPF級動物房，適應性飼養3d[2]后，分成4組，每組6只，均于第28天處死。分別為氣管對照組(QC組)：第0天氣管內注射生理鹽水0.2mL；氣管給藥組(Q組)：第0天氣管內注射博萊霉素5mg·kg-1·d-1，0.2mL；腹腔對照組(FC組)：第0天起腹腔注射生理鹽水0.2mL，連續10d；腹腔給藥組(F組)：第0天起腹腔注射博萊霉素15mg·kg-1·d-1，0.2mL，連續給藥10d。2.2動物模型的制備氣管給藥具體操作方法：①以體積分數10%的水合氯醛按照0.3mL·100g-1腹腔內注射麻醉動物。剃除動物前部頸毛。②將動物固定于操作臺中的鼠板上消毒頸前皮膚后在距胸骨約1cm處縱行切開頸正中皮膚，鈍性分離淺筋膜及肌肉，至能清楚看見氣管環。③將已抽取含博萊霉素5mg·kg-1·d-1，0.2mL或相應體積生理鹽水的1mL注射器(前帶7號針頭)經兩氣管軟骨環間隙朝向心端刺入氣管，將大鼠直立，繼續進針約1cm，回抽無阻力，抽回空氣，注藥，在不影響劑量準確的前提下允許注射器中存有約0.5mL的空氣以確保藥物完全進入氣道。④迅速將動物繞身體長軸左右旋轉30s，使藥物分布均勻。⑤縫合頸部皮膚。局部酒精消毒后放回籠中正常飼養。

腹腔給藥操作方法：常規腹腔注射操作。

2.3觀察指標每天觀察動物的外貌特征，每天晚上測量大鼠體質量，記錄體質量變化情況。28d后腹主動脈放血處死，觀察肺臟外觀，左肺浸泡在體積分數為10%的福爾馬林溶液中固定后，用常規石蠟包埋切片，分別進行HE、Masson染色；取大鼠右肺裝入凍存管用鋁箔紙包好，在液氮中凍存30～60min后，轉至-70 ℃冰箱中儲存，以備制作肺組織勻漿測定羥脯氨酸(HYP)含量。

2.4統計學處理采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1動物一般狀況兩對照組動物均進食正常，毛色光亮，活動自如；兩模型組動物則食欲不振，毛色晦暗，變黃變糙，活動減少，狀態變差，顯示出明顯的病態。3.2動物生存率比較兩對照組動物均無死亡，生存率為100%；Q組有2只死亡，生存率為66.7%；F組有1只死亡，生存率為83.3%，P<0.05。

3.3動物體質量變化給予BLM造模后兩對照組體質量平穩增長，F組動物體質量在1～7d內下降，第8天起開始恢復；Q組動物體質量在前15d內持續下降，第16天起開始恢復。多次腹腔注射給藥組與一次氣管給藥組相比，大鼠體質量減少的個體間差異小，恢復快。見圖1。

圖12種給藥方式小鼠體質量變化

Fig.1Thechangeofrat′sweightinducedbydifferentmedicineadministrationway

3.4肺臟外觀情況2種給藥方法的對照組大鼠雙肺表面光滑，顏色粉嫩，質地均勻，彈性好；模型組情況基本相同，沒有顯著差別，均可見到肺臟萎縮，表面凹凸不平，有大小不等的囊氣腔突出，切開后可見小如針尖、大如米粒的囊腔。組織彈性差，部分區域呈蒼白色，可見散在的出血點及黃白色灶。3.5病理切片檢查2種給藥方法對照組大鼠的肺泡結構清晰，肺泡間隔無炎性細胞，肺泡和間隔內均未見到膠原成分；模型組動物中央氣道和大血管周圍有炎性細胞浸潤，其中以中性粒細胞為主，還可見到成纖維細胞增生，膠原基質增多，肺泡間隔明顯增厚并伴隨細胞浸潤，且纖維組織增生及成纖維細胞灶較多，肺泡腔塌陷，肺組織結構破壞，出現典型的肺纖維化改變。不同的是氣管給藥組膠原纖維分布在氣管周圍，而腹腔給藥組膠原沉積則主要分布在胸膜和肺間質。見圖2。

3.6組織勻漿HYP含量氣管給藥組含量1±0.09μg·mL-1和腹腔給藥組含量1.05±0.05μg·mL-1均顯著高于氣管對照組0.75±0.04μg·mL-1和腹腔對照組0.80±0.04μg·mL-1，差異有統計學意義(P<0.05)；兩模型組含量相近，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2肺組織病理學變化(×200)

A.HE氣管對照組：肺泡結構正常；B.Masson氣管對照組：肺泡結構正常；C.HE氣管給藥組：肺組織結構破壞，大量炎性細胞滲出；D.Masson氣管給藥組：藍色膠原分布在氣管周圍；E.HE腹腔對照組：肺泡結構正常；F.Masson腹腔對照組：肺泡結構正常；G.HE腹腔給藥組：肺泡腔塌陷，大量炎性細胞滲出；H.Masson腹腔給藥組：藍色膠原主要分布在肺間質

Fig.2Pathologicalchangesinlungtissue(×200)

A.HEintratrachealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；B.Massonintratrachealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；C.HEintratrachealadministrationgroup:thepulmonaryarchitecturewasdestroyed，andthemassiveinfiltrationofinflammatorycellwasshown；D.Massonintratrachealadministrationgroup:collagenwaslocatednearthebronehia；E.HEintraperitonealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；F.Massonintraperitonealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；G.HEintraperitoneallyadministeredgroup:thepulmonaryarchitecturewasdestroyed，andthemassiveinfiltrationofinflammatorycellwasshown；H.Massonintraperitoneallyadministeredgroup:collagenwasevenlydistributedinpulmonaryinterstialspace

4　討論

BLM是用于治療多種腫瘤細胞毒性的藥物，使用早期會出現全身炎癥反應及類似肺炎癥狀，后期可產生呈進行性發展的嚴重肺間質纖維化[15]。由于其導致的動物肺間質纖維化與人類肺間質纖維化病理過程相似，故用BLM復制肺纖維化動物模型被認為最接近于人的(IPF)病理特征[13,16]。本實驗選用日本化藥株式會社生產的BLM。國產的博萊霉素A5 (BLM-A5)又名平陽霉素，是從我國浙江省平陽縣土壤中的放線菌培養液中分離得到的抗腫瘤抗生素。經研究與國外的BLM成分相近。二者比較，BLM是多組分的復合藥，主要成分為A2；平陽霉素則為單一的A5[17]。BLM與BLM-A5都是治療多種腫瘤的細胞毒藥物，具有導致肺間質纖維化的不良反應，并常用于復制肺纖維化動物模型。但張曉曄等[18]研究表明：BLM可在肺間質形成廣泛的纖維化；但BLM-A5僅引起輕微的肺組織損傷，無法形成明顯的間質纖維化。

經氣管給藥復制IPF模型的優點是方便、經濟、可靠。此方法雖然要經過氣管滴注，但僅需1次給藥，與連續10d腹腔注射的造模方法相比操作方便。因造模藥物昂貴，經氣管給藥所需藥量僅為經腹腔給藥所需藥量的1/30，故經氣管給藥是非常經濟的。此方法的缺點是對實驗動物有一定的損傷，操作技術要求高。肺臟的結構特點決定了藥物在肺部很難分布均勻。實驗中雖采用了給藥后直立旋轉動物的方法，但BLM在左右兩側的數個肺葉中仍無法分布均勻。由于BLM致肺纖維化具有劑量依賴性[19]，若進入各肺葉的BLM劑量不同，則各肺葉的纖維化程度也會有較大差異。預實驗中曾發現經氣管給藥的個別大鼠在給藥后仍活潑好動、狀態良好，說明BLM只進入了部分肺葉，尚有一些肺葉未發生纖維化，故動物的呼吸功能并未受到明顯影響，這也是影響該方法造模成功的主要原因。但只要操作標準，確保BLM完全進入氣管，給藥后對動物進行充分旋轉使藥物在兩肺分布均勻，就可最大限度避免缺陷、保證造模成功。另外，氣管內注射BLM，需麻醉大鼠后手術剖開頸部皮膚，鈍性分離肌肉組織使氣管暴露，存在感染及術中損傷造成大鼠死亡的危險，故操作中應盡量縮短操作時間、避免組織損傷，以期提高造模成功率。

采用腹腔注射BLM復制大鼠IPF模型操作簡單、個體間差異小，給藥劑量容易掌握，可減輕因手術操作差異造成的纖維化程度的差異。操作中應注意使大鼠處于頭低腳高位，以避免誤傷腹腔臟器。

2種給藥方法復制IPF相比較，腹腔注射BLM后，BLM經循環系統進入肺臟，故病變主要分布于肺組織及胸膜下；氣管內注射的BLM經支氣管上皮吸收后，可在支氣管周圍形成局部的BLM高濃度區域；因此，可在支氣管周圍而非周邊肺組織形成明顯的纖維化改變。腹腔注射法與臨床IPF病理分布更為接近，但二者所引起肺間質的病理改變并無明顯差別。氣管注射BLM以其操作簡便、成模周期短和節省造模用藥的明顯優勢，成為世界公認的大鼠IPF模型的制備方法。

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Comparative study of 2 kinds of methods to induce pulmonary fibrosis model in rats

YAN Li1，XIE Yanhua1，YANG Qian1，WANG Siwang1*,CUI Jiahui2,WU Rangxin2

(1.Department of Natural Medicine，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China;2.The Fourth Militory Medical University，Xi′an 710032，China)

ObjectiveToexplorethesimilaritiesanddifferencesbetweentheintratrachealandintraperitonealinjectiontoprepareidiopathicpulmonaryfibrosis(IPF)ratmodel.Methods24maleSDrats240-260g，wererandomlydividedintointratrachealcontrolgroup(QCgroup)，intratrachealadministrationgroup(Qgroup)，intraperitonealcontrolgroup(FCgroup)andintraperitoneallyadministeredgroup(Fgroup)，n=6.Theyweretreatedwithasingleintratrachealinjectionofsaline0.2mLorbleomycin(BLM) 5mg·kg-1·d-1；intraperitonealinjectionofsaline0.2mLorBLM15mg·kg-1·d-1，for10daysconsecutively.Allratswerekilledat28days.Thesurvivalrate，weight，lungappearance，pathologicalchangesandlungtissuehydroxyprolinecontentofeachgroupwereobserved.ResultsQgroupsurvivalratewas66.7%；Fgroupsurvivalratewas83.3%.Therewasasignificantdifference(P<0.05)betweenthe2groups.TheweightoftheratsgivenBLMwaslostafterinjection，theweightofFgroupwaslessonedinthefirst7daysandstartedtorecoveronthe8thday；theweightofQgroupcontinuouslydeclinedinthefirst15daysandbegantorecoversincethe16thday.TherewasnosignificantdifferencebetweenQgroupandPgroupinlungappearance.Fibrosiswaswidelyandstablyformed,mainlyaroundthetracheainthegroupQ，however，thesamechangesweremainlyseenunderthepleuraandpulmonaryinterstialspaceintheratofgroupP.Lungtissuehydroxyprolineofthe2modelswassignificantlyhigherthancontrolgroups，thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05)；buttherewasnodifferencebetweenthe2models.ConclusionIntratrachealadministrationandintraperitonealadministrationshowednosignificantdifferenceforpulmonaryfibrosisinrats.

bleomycin；pulmonaryfibrosis；model

閆莉，女，碩士

王四旺，男，教授，博士生導師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.014

R965

A

1004-2407(2016)05-0485-05

2015-11-16)