以細胞篩為載體的玻璃化冷凍和慢速程序化冷凍保存人卵巢組織的效果比較

姬萌霞，孫正怡，郁琦，甄璟然，王雪，劉美芝

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦產科，北京　100730)

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·實驗研究·

以細胞篩為載體的玻璃化冷凍和慢速程序化冷凍保存人卵巢組織的效果比較

姬萌霞，孫正怡*，郁琦*，甄璟然，王雪，劉美芝

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦產科，北京100730)

目的比較以細胞篩為載體的玻璃化冷凍與慢速程序化冷凍用于人卵巢組織冷凍的效果。方法人卵巢組織取皮質切塊后，隨機分為3組：新鮮組織對照組(F組)、慢速程序化冷凍組(S組)及以細胞篩為載體玻璃化冷凍組(V組)。卵巢組織冷凍復蘇后，固定切片后行蘇木素-伊紅染色，觀察卵泡形態；使用TdT介導的dUTP缺口末端標記技術，觀察卵泡凋亡情況；部分卵巢組織體外培養，隔日采集培養液后檢測雌二醇(E2)濃度。比較三組卵泡正常形態率、卵泡凋亡率及E2濃度。結果與F組原始卵泡正常形態率(91.1%)相比，V組原始卵泡正常形態率(88.1%)無顯著差異(P>0.05)，而S組原始卵泡正常形態率(79.6%)顯著下降(P<0.001)；V組初級卵泡正常形態率(74.2%)與S組(73.6%)相似，但兩組均低于F組(89.0%)(P<0.05)；凋亡檢測中，3組凋亡率無顯著差異(P>0.05)；體外培養2周，各組E2濃度持續上升，F組E2濃度顯著高于S組、V組(P<0.001)，而S組與V組E2濃度無顯著差異(P>0.05)。結論以細胞篩為載體的玻璃化冷凍能較好地保存人卵巢組織，復蘇后組織體外培養后，還可持續分泌E2。

細胞篩；玻璃化冷凍；慢速冷凍；卵巢冷凍；生育力保存

【Abstract】

Objective：To compare the cryopreservation effect of human ovarian tissue between vitrification with a cell strainer as the carrier and slow freezing procedures.

Methods：Human ovarian tissue was retrieved from 4 women undergone oophorectomy. After processing，the ovarian cortexes were randomly assigned to three groups：fresh group as a control，slow freezing group and vitrification group. The cell strainer was applied as a carrier of vitrification. After thawing，the tissues were fixed for histological examination and apoptosis analysis with TUNEL assay. Besides，part of thawed tissues were cultured in vitro，and estradiol (E2) concentration in the medium was tested. Relative results were compared among the three groups.

Results：The rate of morphologically normal primordial follicles were comparable between the fresh group (91.1%) and vitrification group (88.1%)(P>0.05)，while that of slow freezing group was significantly decreased (79.6%) (P<0.001). Morphologically normal primary follicles were similar between the slow freezing group (73.6%) and vitrification group (74.2%)，but both were significantly lower than that of the fresh group (89.0%)(P<0.05). The apoptosis rate was not significantly different among the three groups (P>0.05). After culturing in vitro for 2 weeks，the concentration of E2continued to rise. E2concentration in the fresh group was significantly higher than that in slow freezing group and vitrification group (P<0.001)，but E2concentration was comparable between slow freezing group and vitrification group (P>0.05).

Conclusions：Vitrification with cell strainers as carriers is effective for human ovarian tissue cryopreservation. After thawed and cultured in vitro，these tissue can secret E2.

(JReprodMed2016，25(9)：821-826)

隨著腫瘤診治的進展，越來越多的女性腫瘤患者可以獲得長期生存，但手術、放療、化療等治療都有可能損傷患者的生育功能；一些良性疾病，如系統性紅斑狼瘡、地中海貧血等疾病在治療的過程中也可能損傷性腺；Turner綜合征、卵巢早衰家族史的女性發生卵巢早衰的風險較大[1]。以上女性客觀上都有生育力保存的需求。

卵母細胞凍存、胚胎凍存是生育力保存的經典方法。但這些方法必須超促排卵，在一些進展迅速的腫瘤中有可能延誤治療時機，促排卵藥物使用后雌激素濃度異常增高，還可能加速如子宮內膜癌、乳腺癌等激素依賴性腫瘤的進展[2]；另外，胚胎凍存并不適用于沒有配偶的女性。對于那些疾病進展迅速、迫切需要放化療的女性，卵巢組織冷凍可作為生育力保存的又一選擇。

慢速程序化冷凍與玻璃化冷凍是卵巢組織冷凍可采取的兩種方法，其中又以前者為主[2]。玻璃化冷凍在胚胎和卵母細胞凍存上占據優勢，但用于卵巢組織冷凍的效果和安全性還在研究當中。其中，冷凍載體的選擇是關系到玻璃化冷凍效果的重要因素[3]。本研究擬采用細胞篩作為冷凍載體，觀察卵巢組織玻璃化冷凍的效果。

材料與方法

一、卵巢組織的獲取及處理

1.標本來源：年齡在18～38歲行附件切除術的4例女性患者，其中2例為子宮內膜癌，2例為血管平滑肌瘤病。平均年齡(32.8±4.5)歲，2例既往有生育史，2例未育。截取少量卵巢皮質組織作為實驗標本；所有患者在試驗前簽署知情同意書。本研究獲得協和醫院倫理委員會批準。

2.卵巢組織處理：將手術切除的卵巢組織置于G-MOPS plus溶液(Vitrolife，瑞典)中，室溫下帶回實驗室。于37℃超凈臺上用尖刀片剔除卵巢血管結締組織，將卵巢皮質切成(1～2)mm×(2～3)mm×(2～3)mm的組織塊。同一病例來源的卵巢組織塊隨機分新鮮對照組(F組)、慢速程序化冷凍組(S組)及玻璃化冷凍組(V組)；每組卵巢組織塊為10塊。

二、卵巢組織的冷凍與復蘇

冷凍基礎液為G-MOPS plus溶液(Vitrolife，瑞典)，其余試劑均購自美國Sigma公司，以G-MOPS plus作為溶媒配制冷凍保護液。所有溶液均通過0.22 μm孔徑過濾器(Millipore，法國)除菌后再使用。

1.慢速程序化冷凍方法(S組)：冷凍保護劑為丙二醇(PROH)與蔗糖，載體為冷凍管。冷凍保護液1中含1.5 mol/L PROH，冷凍保護液2含1.5 mol/L PROH與0.1 mol/L 蔗糖。室溫下(22℃～25℃)將處理過的組織塊轉移到冷凍保護液1中充分浸沒，5 min后轉移至裝有1.8 ml冷凍保護液2的冷凍管中，4℃下平衡30 min，最后轉到程序化冷凍儀進行程序化冷凍。

程序冷凍儀運行程序如下：①自4℃開始，-2℃/min降到-8℃；②在-8℃維持10 min后進行手工植冰；-8℃維持10 min；③以-0.3℃/min速度降溫到-40℃；④以-30℃/min速度降溫到-150℃；⑤迅速投入液氮中保存。

2.玻璃化冷凍方法(V組)：冷凍保護劑為二甲亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、蔗糖、聚蔗糖(Ficoll 400)，載體為細胞篩(BD，美國)，孔徑100 μm。預平衡液中含7.5%(v/v)DMSO與7.5%(v/v)EG，玻璃化冷凍液中含15%(v/v)DMSO、15%(v/v)EG、5.8 mg/ml Ficoll 400、0.58 mg/ml蔗糖。將卵巢組織塊平鋪于細胞篩上(圖1)，將細胞篩移至預平衡液中，使組織塊充分浸沒，平衡5 min，再轉移至玻璃化冷凍液中平衡5 min，無菌濾紙吸取多余冷凍液后迅速投入液氮，置于液氮罐內保存。

圖1　置于冷凍液內的細胞篩

3.復蘇方法：S組與V組均使用相同的方法進行復蘇。液氮中取出卵巢組織，空氣中停留5～10 s后，以冷凍管為載體的S組置于37℃水浴解凍至肉眼所見冰晶溶解，以細胞篩作為載體的V組無需水浴，直接復蘇。兩組的復蘇過程相同，卵巢組織依次投入蔗糖濃度為0.67、0.33、0.20、0 mol/L的復蘇液中，充分洗滌，平衡5 min。復蘇完成后一部分組織進行體外培養，另一部分用4%多聚甲醛固定，留待組織學分析。

三、卵巢組織的制片、染色及形態學分析

3組卵巢組織經4%多聚甲醛固定后脫水、浸蠟包埋后切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。單盲法觀察切片中各卵泡的形態，每10個組織切面分析一次。

卵母細胞完整，細胞核及核仁清晰可見，顆粒細胞排列規則的卵泡定義為形態正常卵泡；卵泡結構不完整或消失，卵母細胞皺縮，核固縮，胞質內可見空泡，顆粒細胞排列紊亂，或許多顆粒細胞出現核固縮的卵泡定義為形態異常卵泡。卵泡分類依據Gougeon標準[4]，因切片中以原始卵泡和初級卵泡為主，故只統計二者卵泡正常形態率。為防止重復計數，僅計數有卵母細胞核的卵泡。

四、卵巢組織凋亡檢測

3組卵巢組織石蠟切片每組隨機挑選兩張進行凋亡檢測，檢測方法為TdT介導的dUTP缺口末端標記技術(TUNEL)，具體按TUNEL試劑盒(Roche，瑞士)說明書進行。呈棕黃色的為陽性細胞，卵母細胞陽性或50%以上的顆粒細胞陽性定義為卵泡凋亡。

觀察3組卵泡凋亡情況并計算凋亡率。原始卵泡凋亡率為凋亡原始卵泡數與整張切片原始卵泡總數之比，初級卵泡凋亡率為凋亡初級卵泡數與整張切片初級卵泡總數之比。

五、卵巢組織的體外培養

體外培養體系參照既往研究方法[5-7]，部分略有改進。培養器皿為含有嵌入式小室的Transwell-24孔板(Corning，美國)。小室預先用100 μl稀釋的matrigel膠(BD，美國)包被，小室外室加入培養液600 μl，小室內加入培養液200 μl。培養液主要成分為α-MEM(Corning，美國)，其中加入50 ml/L 人血清白蛋白(HSA，Sage，美國)、10 ml/L 胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS，Corning，美國)、0.5 U/ml人絕經期促性腺激素(HMG，麗珠醫藥)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素(Corning，美國)。

將卵巢組織切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織粒放入小室中，每組各放置4個小室，每個小室中放置卵巢組織塊2粒，置37℃、5%CO2培養箱中培養14 d。隔日吸取外室培養液400 μl，收集后置于-20℃下凍存，同時補充等量新鮮培養液。

培養結束后，將隔天收集的培養液統一進行雌二醇(E2)濃度檢測，以新鮮培養液作為空白對照。所用方法為化學免疫發光法，試劑盒由美國Beckman Coulter公司提供，檢測按說明書要求進行。

六、統計方法

數據用SPSS 21.0 統計軟件處理，3組卵泡正常形態率與凋亡率比較使用χ2檢驗分析。體外培養E2水平比較使用重復測量的方差分析，各組之間兩兩比較用LSD方法。P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

一、組織學分析

HE染色切片顯示，卵巢組織中卵泡散在分布，以原始卵泡、初級卵泡為主，各組均可見到形態正常及異常的原始卵泡和初級卵泡(圖2)。

V組原始卵泡正常形態率接近于F組(88.1% vs.91.1%)，無統計學差異(P>0.05)，兩組卵泡正常形態率均顯著高于S組(P<0.001)；S組、V組初級卵泡正常形態率均低于F組(P<0.05)，但S組與V組之間無統計學差異(P>0.05)(表1)。

二、卵泡凋亡分析

無論是原始卵泡還是初級卵泡，3組間卵泡凋亡率均無統計學差異(P>0.05)(圖3、表2)。

表1　三組卵巢組織形態學分析 [n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.001；與F組相比，#P<0.001，?P<0.02

三、體外培養E2濃度檢測

體外培養2周后，E2濃度不斷增加(P<0.001)；其中，F組濃度顯著高于S組(P=0.002)與V組(P=0.001)，但S組與V組無統計學差異(P>0.05)(圖4)。

表2　三組卵巢組織切片凋亡率分析[n(%)]

A：新鮮組形態正常的原始卵泡和初級卵泡(×200)；B：玻璃化冷凍組的原始卵泡和初級卵泡，形態基本正常(×200)；C：慢速冷凍組的原始卵泡和初級卵泡，卵泡膜皺縮，形態異常(箭頭處)(×200)；D：凍融后的原始卵泡，卵泡膜皺縮，形態異常(箭頭處)(×400)圖2　卵巢組織切片形態學(HE染色)

A：新鮮組織中正常的初級卵泡，顆粒細胞和卵母細胞染色陰性(×200)；B：玻璃化冷凍組凋亡的原始卵泡，超過50%的顆粒細胞染色陽性，部分間質細胞染色陽性(×200)；C：慢速冷凍組正常的初級卵泡，卵母細胞核染色陽性，部分間質細胞染色陽性(×200)；D：部分顆粒細胞凋亡(紅色箭頭處)，但卵母細胞未凋亡(黑色箭頭處)的卵泡(×400)圖3　卵巢組織切片卵泡凋亡檢測(TUNEL 染色)

討　　論

對于需要保存生育力的患者而言，卵巢組織可以通過腹腔鏡等微創手術獲取，不受月經周期的限制，不影響腫瘤等原發疾病的后續治療；復蘇移植后除了有望生育，還可能恢復內分泌功能；卵巢組織內儲存了大量處于休眠狀態的原始卵泡，其中的卵母細胞處于第一次減數分裂時期，比較穩定，沒有皮質顆粒和透明帶等支持結構，利于冷凍保護劑的滲透，理論上對凍融過程的耐受程度更高。但是，卵巢組織厚度(約1 mm)遠大于胚胎和卵母細胞，豐富的結締組織會阻礙冷凍保護劑的滲透，影響冷凍效果；另外，卵巢組織內細胞種類較多，包括基質細胞、卵泡膜細胞、顆粒細胞、卵母細胞等多種細胞，冷凍保護劑對不同類型細胞的作用各不相同，如何在其間達成平衡，最大限度的保存生育力是一個艱巨的任務。因此，與發展較為成熟的胚胎凍存和卵母細胞凍存相比，卵巢組織凍存仍是研究性質，尚未大規模應用于臨床。

卵巢組織冷凍有兩種方法：慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍。目前卵巢組織冷凍復蘇再移植后成功妊娠的報道已有35～40例[8]，均使用慢速程序化冷凍。盡管玻璃化冷凍具有操作簡便，無需精密儀器控溫、耗時少、冷凍損傷小等特點，在胚胎和卵母細胞凍存上已基本取代了慢速程序化冷凍。但是，在卵巢組織冷凍上，玻璃化冷凍與慢速程序化冷凍孰優孰劣，尚無定論。Tanpradit等[9]比較慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍保存貓卵巢組織，發現后者的卵泡正常形態率較低，凋亡率較高，有顯著差異(P<0.05)。Keros等[10]比較了人卵巢組織經玻璃化冷凍與慢速程序化冷凍后的切片，發現兩組卵泡正常形態率與超微結構物有顯著差異(P<0.05)，但前者對于基質的凍存效果更佳。而Herraiz等[11]以牛卵巢組織作為研究對象卻發現，與玻璃化冷凍組相比，慢速程序化冷凍組閉鎖卵泡比例較高，異體移植后，慢速程序化冷凍組的原始卵泡和次級卵泡密度降低(P<0.05)，提示玻璃化冷凍效果優于慢速程序化冷凍。這些研究結論不一致的原因可能在于影響玻璃化冷凍效果的因素較多，如冷凍載體、冷凍保護劑的選擇、卵巢組織的體積差異等。其中，冷凍載體的選擇尤為重要。

玻璃化冷凍的原理是將在冷凍保護劑中平衡好的卵巢組織投入液氮中快速降溫，達到一種“玻璃化”狀態，避免冰晶形成，減少冷凍損傷。實現快速降溫的重要步驟之一是冷凍載體的選擇。目前采用的載體包括冷凍管、開放式拉長麥管、電鏡用銅網、Cryoloop、鋁箔槽等[3]。冷凍管管壁較厚，蓄積的冷凍保護液較多，對組織毒性較大，降溫速度慢，不利于形成玻璃化狀態；開放式拉長麥管管徑較小，只能容納1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，對卵巢組織處理的要求較高；電鏡銅網和Cryoloop可使組織與液氮直接接觸，蓄積的冷凍液較少，但投入液氮時會在組織周圍形成蒸汽隔熱層，影響降溫速度；鋁箔槽內的組織塊置入液氮后會卷曲成團，與液氮總接觸面積減少，降溫速度下降，且每次只能處理一個組織塊，操作繁瑣，總冷凍時間長。本研究中選用的載體細胞篩是用于細胞培養、雜質過濾、細胞分散的工具，主要材質為聚丙乙烯，孔徑為100 μm，可使液氮和冷凍保護劑迅速滲透，底面半徑約0.8 cm，一次可放置8～10個卵巢組織塊，可保持平鋪的狀態，并不發生卷曲，投入液氮前用濾紙吸取多余冷凍液，盡可能減少投入液氮后產生的蒸汽，迅速降溫形成玻璃化狀態。從切片中可見，玻璃化冷凍組原始卵泡正常形態率顯著高于慢速冷凍組，接近新鮮組織；初級卵泡形態正常率與慢速冷凍相似，說明玻璃化冷凍可能對原始卵泡的保存效果更好。由上可見，細胞篩作為玻璃化冷凍的載體是可行的，這也是本研究的創新之處。

卵泡凋亡是卵巢組織無時無刻不在發生的過程。女性出生時卵巢組織內的原始卵泡為200萬左右，一生中僅有400多個卵泡發育成熟，其余都通過凋亡而閉鎖[12]。冷凍過程是否會誘導卵泡凋亡？在這一問題上的研究結果不一致。一些研究認為，與新鮮卵巢組織相比，凍融后的卵巢組織凋亡細胞增多，凋亡率顯著增加(P<0.05)[13-14]；但是，也有研究者發現冷凍組織和新鮮組織的凋亡率并無顯著差異[5，8]。本研究發現，冷凍組織的凋亡率雖略高于新鮮組織，但未達到統計學差異。由于TUNEL檢測細胞凋亡僅是一種半定量方法，冷凍過程究竟是否增加卵泡凋亡仍需定量的方法來測定。

卵巢組織體外培養后仍可繼續生長，表現為組織內初級卵泡比例增加，顆粒細胞肥大，培養液中可檢測到E2、孕酮(P)。Wotiz等[15]研究認為，除卵泡外，體外培養的基質細胞也可分泌E2。Isachenko等[16]也發現，即使卵巢組織塊內沒有卵泡，體外培養后的P水平與正常對照組相比無顯著差異。這些提示基質細胞可能也具備分泌類固醇激素的功能，在冷凍過程中未受到損傷。多個研究將玻璃化冷凍與慢速程序化冷凍的卵巢組織復蘇后體外培養，隔日取培養液檢測E2、P水平，均呈持續上升的趨勢[5-7]。本研究采用類似的體外培養系統，結果與上述研究一致。可見，經過冷凍后，原始卵泡、初級卵泡、基質細胞等仍保存了一定的內分泌功能，這一切為后續移植奠定了基礎。受倫理限制，本研究未能將卵巢組織移植到人體內，未能進一步檢測凍融組織的內分泌功能。這也是我們未來研究努力的方向。

總之，本研究創新性地將細胞篩作為載體應用于玻璃化冷凍，通過比較切片中卵泡正常形態率、凋亡率，以及體外培養過程中的E2濃度，發現其凍存效果與慢速程序化冷凍相當。細胞篩用于玻璃化冷凍是切實可行的。

[1]Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Ovarian tissue cryopreservation：a committee opinion[J]. Fertil Steril，2014，101：1237-1243.

[2]Macklon KT，Jensen AK，Loft A，et al. Treatment history and outcome of 24 deliveries worldwide after autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue，including two new Danish deliveries years after autotransplantation[J]. J Assist Reprod Genet，2014，31：1557-1564.

[3]Amorim CA，Curaba M，Van Langendonckt A，et al. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue[J/OL]. Reprod Biomed Online，2011，23：160-186.

[4]Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human：a model from preliminary results[J]. Hum Reprod，1986，1：81-87.

[5]符曉倩，何方方，甄璟然. 兔卵巢組織慢速冷凍和玻璃化冷凍保存方法的研究[J]. 生殖醫學雜志，2011，20：400-405.

[6]朱夏琴，孫正怡，郁琦，等. 小鼠卵巢組織冷凍保存方法對組織內分泌功能的影響[J]. 生殖醫學雜志，2014，23：470-474.

[7]Li YB，Zhou CQ，Yang GF，et al. Modified vitrification method for cryopreservation ofhuman ovarian tissues[J]. Chin Med J (Engl)，2007，120：110-114.

[8]Talevi R，Barbato V，Fiorentino I,et al. Successful slush nitrogen vitrification of human ovarian tissue[J]. Fertil Steril，2016,105:1523-1531.

[9]Tanpradit N，Comizzoli P，Srisuwatanasagul S，et al. Positive impact of sucrose supplementation during slow freezing of cat ovarian tissues on cellular viability，follicle morphology，and DNA integrity[J]. Theriogenology，2015，83：1553-1561.

[10]Keros V，Xella S，Hultenby K，et al. Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue[J]. Hum Reprod，2009，24：1670-1683.

[11]Herraiz S，Novella-Maestre E，Rodríguez B，et al. Improving ovarian tissue cryopreservation for oncologic patients：slow freezing versus vitrification，effect of different procedures and devices[J]. Fertil Steril，2014，101：775-784.

[12]豐有吉，沈鏗 主編. 婦產科學[M]. 北京：人民衛生出版社，2005.

[13]Rimon E，Cohen T，Dantes A，et al. Apoptosis in cryopreserved human ovarian tissueobtained from cancer patients：a tool for evaluating cryopreservation utility[J]. Int J Oncol，2005，27：345-353.

[14]Youm HW，Lee JR，Lee J，et al. Optimal vitrification protocol for mouse ovarian tissue cryopreservation：effect of cryoprotective agents and in vitro culture on vitrified-warmed ovarian tissue survival[J]. Hum Reprod，2014，29：720-730.

[15]Wotiz HH，Davis JW，Lemon HM，et al. The conversion of testosterone-4-C14 to estrogens by human ovarian tissue[J]. J Biol Chem，1956，222：487-495.

[16]Isachenko V，Isachenko E，Rahimi G，et al. Cryopreservation of human ovarian tissueby direct plunging into liquid nitrogen：negative effect of disaccharides in rapid freezingsolution[J]. Cryo Letters，2002，23：333-344.

[編輯：羅宏志]

Cryopreservation effect of cell strainer as a novel carrier of vitrification for human ovarian tissue

JI Meng-xia，SUN Zheng-yi*，YU Qi*，ZHEN Jing-ran，WANG Xue，LIU Mei-zhi

DepartmentofObstetrics&Gynecology，PekingUnionMedicalCollegeHospital，PekingUnionMedicalCollege/ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100730

Cell strainer；Vitrification；Slow freezing；Ovarian tissue cryopreservation；Fertility preservation

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.011

2016-03-11；

2016-04-06

2015年度默克雪蘭諾中國生殖醫學研究基金

姬萌霞，女，山西太原人，博士研究生，生殖內分泌專業.(*

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