枇杷果皮內生真菌生物學特性

曾壟鋼 魯海菊 盧寧強 潘柳君 鄭肖蘭

摘要：本試驗采用生長速率法對抗石榴干腐病病原真菌的6株枇杷（Eriobotrya japonica）果皮內生真菌進行生物學特性研究。結果表明，PGSC8菌株在PDA培養基中生長最好，PGSC9在PDA和CA培養基中生長最好，PGSC1、PGSC5、PGSC6、PGSC7 4個菌株在PSA培養基中菌絲生長最好。供試的碳源中，PGSC5和PGSC6 2個菌株最適碳源為麥芽糖，PGSC1、PGSC7、PGSC8、PGSC9 4個菌株最適碳源為可溶性淀粉。供試氮源中，PGSC6、PGSC9 2個菌株最適氮源為牛肉膏，PGSC7菌株最適氮源為酵母膏和牛肉膏，PGSC1、PGSC5、PGSC8 3個菌株最適氮源為蛋白胨。所有參試菌株適宜菌絲生長的pH為中性或偏堿性，PGSC7最適合的生長溫度為25 ℃，其余5個菌株最適合的生長溫度為30 ℃。全光照處理有利于參試菌株菌絲生長。

關鍵詞：枇杷（Eriobotrya japonica）； 內生真菌； 石榴干腐病； 生物學特性

中圖分類號：S667.3；S476+.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1168-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.020

Study of Biological Characteristics of Bio-control Endophytic Fungi

from Eriobotrya japonica

ZENG Long-gang1，2， LU Hai-ju1， LU Ning-qiang1， PAN Liu-jun1， ZHENG Xiao-lan3

（1.Department of Life Science and Technology， Honghe College，Mengzi 661199， Yunnan，China；

2.Yunnan Pingbian Plant Protecting Station， Pingbian 661200， Yunnan，China；

3.Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences Environment and Plant Protection Institute，Danzhou 571737， Hainan，China）

Abstract： The effects of medium， carbon and nitrogen source， pH， temperature and illumination were tested by mycelium growth rate for 6 Eriobotrya japonica endophyte strains significantly antagonized pathogen of fruit dry rot of pomegranate. The results showed that the proper growth medium of PGSC8 strain was PDA. PGSC9 strain was PDA and CA. The other 4 strains was PSA. In the tested carbon sources， the proper carbon source of 2 strains including PGSC5 and PGSC6 was the maltose. The other 4 strains was the soluble starch. In the tested nitrogen sources， the proper nitrogen source of 2 strains including PGSC6 and PGSC9 was the beef extract， and PGSC7 strain was the yeast extract and the beef extract. The other 3 strains was the peptone. And the proper pH of all the tested strains was neutral or alkaline， the proper temperature of PGSC7 was 25 ℃. The other 5 strains was 30 ℃.

Key words： Eriobotrya japonica； endogenetic fungus； fruit dry rot of pomegranate； biological characteristics

枇杷（Eriobotrya japonica）為薔薇科常綠喬木果樹，是中國亞熱帶地區的特色水果[1]。始載于《神農本草經》，含川貝堿、西貝素等多種生物堿[2]。植物內生真菌普遍存在于各種植物健康組織內或細胞間隙，不僅能促進寄主植物生長，還可以產生與寄主相同或相似的次級代謝產物，具有抗菌、殺蟲等多種生物活性[3-6]。目前，尚未見枇杷內生真菌的研究報道。為此，本課題組對枇杷內生真菌開展系列研究。石榴干腐病是石榴生產上發生嚴重而普遍的病害之一，陜西[7]、安徽[8]、河南[9，10]、云南[11]等省份都陸續報道有石榴干腐病發生，損失率高達40%[7]以上。此病害果實腐爛干縮是其癥狀之一，果部病害使用化學農藥會出現農藥殘留問題，生物防治可以彌補其不足。鑒于此，本試驗從枇杷果皮內生真菌中篩選具有抗石榴干腐病病原菌的生防菌株，對其進行生物學特性研究，為工業發酵提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枇杷主干內生真菌 從蒙自枇杷園區采集枇杷果皮，常規組織分離[10]獲得6株參試菌株，分別為PGSC1、PGSC5、PGSC6、PGSC7、PGSC8和PGSC9，均為鏈格孢屬（Alternaria spp.）。

1.1.2 供試培養基 ①馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉 20 g、去離子水1 000 mL。②馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）：馬鈴薯200 g、蔗糖16 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。③玉米粉培養基（CM）：玉米粉30 g、瓊脂粉17 g、去離子水1 000 mL。④小麥瓊脂培養基（WA）：小麥粉30 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。⑤枇杷瓊脂培養基（LA）：枇杷葉200 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。⑥胡蘿卜瓊脂培養基（CA）：胡蘿卜200 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。⑦查氏培養基（Czapeks medium CZ）：硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。以上所有配制好的培養基用高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌25 min備用。

1.1.3 藥品及試劑 碳源有可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇；氮源有酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨。上述材料均購自農貿市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養基對不同菌株菌絲生長影響的測定 將枇杷主干內生真菌接種在PDA平板培養基中，28 ℃恒溫擴大培養7 d [12]，在培養基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，同時接種于PDA、PSA、CM、WA、CA、LA 和CZ 7種培養基平板中央，每種培養基設3次重復，在28 ℃下恒溫培養，7 d后十字交叉法[12]測定各菌株菌落直徑。

1.2.2 碳、氮源對不同菌株菌絲生長影響的測定 以查氏培養基為基礎培養基，分別用相等質量分數的碳（可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇）和氮（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨）替換蔗糖和硝酸鈉，接種及測量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.3 pH對不同菌株菌絲生長影響的測定 以PDA為供試培養基，分別用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉將pH調至4、5、6、7、8、9和10，接種及測量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.4 溫度對不同菌株菌絲生長影響的測定 以PDA為供試培養基，接種后分別在5、10、15、20、25、30、35和40 ℃下恒溫培養，接種及測量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.5 光處理對不同菌株菌絲生長影響的測定 以PDA為供試培養基，接種后分別在光暗交替（12 h光照12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光處理下培養，接種及測量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.6 數據統計 所有試驗數據均采用 SPSS19.0統計軟件Duncan多重比較法進行統計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 培養基對不同菌株菌絲生長的影響

由表1可知，7種供試培養基中，PGSC1、PGSC5、PGSC6和PGSC7 4個菌株在PSA培養基中的菌落直徑與其他培養基差異極顯著，且菌落直徑最大，說明這4株內生菌最適合的培養基為PSA。PGSC8和PGSC9 2個菌株在PDA培養基中的菌落直徑與其他培養基差異極顯著，且菌落直徑最大，說明這2株內生菌最適合的培養基為PDA。此外CA培養基也適合PGSC9和PGSC6菌株生長。不同供試菌株在其余培養基中也能生長，只是菌落直徑略小一些。總之，參試菌株在不同培養基上均能正常生長，具有較強的營養適應性。

2.2 碳源對不同菌株菌絲生長的影響

由表2可知，參試菌株在可溶性淀粉培養基中，較其他碳源培養基菌絲生長差異極顯著，說明6種供試的碳源，最易被其利用的是可溶性淀粉。菌株PGSC5、PGSC6在麥芽糖培養基上菌絲生長也較好。參試菌株PGSC6在無碳源對照上菌絲生長直徑為12.3 cm，與其他6種培養基差異極顯著，說明該菌株對碳源的需求比其他參試菌株敏感。在無碳對照中，PGSC5菌落直徑最大，但菌絲非常稀薄。

2.3 氮源對不同菌株菌絲生長的影響

由表3可知，供試的7種氮源對參試菌株菌絲生長存在差異性，總體分析發現有機氮源更適合參試菌株菌絲生長，其中PGSC1、PGSC5和PGSC8最適合的氮源為蛋白胨，PGSC6、PGSC7和PGSC9最適合的氮源為牛肉膏。酵母膏也適合PGSC7菌株生長。此外參試菌株在無氮對照培養基上，有些菌株菌絲生長較快，但菌絲稀薄。

2.4 pH對不同菌株菌絲生長的影響

由表4可知，在不同pH環境下各參試菌株菌落直徑有差異，PGSC5、PGSC6、PGSC7、PGSC8 4個參試菌株菌絲生長最適合的pH為7，其余2株最適合的pH為10。表明pH中性或偏堿性適合參試菌株菌絲生長。

2.5 溫度對不同菌株菌絲生長的影響

由表5可知，參試菌株在10～35 ℃范圍內菌絲均能生長，5 ℃和40 ℃菌絲均不能生長。其中，PGSC7最適合的生長溫度為25 ℃，其余5個菌株最適合的生長溫度為30 ℃。

2.6 光照對不同菌株菌絲生長的影響

由表6可知，在光暗交替（12 h光照12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光照處理下，參試菌株菌絲均能生長，全光照與其余2種光處理差異極顯著，說明全光照有利于參試菌株菌絲生長。

3 小結與討論

本研究結果表明，參試菌株在7種培養基上均能正常生長，多數菌株適合在PSA培養基中生長，PGSC8菌株適合在PDA培養基中生長最好，PGSC9在PDA和CA培養基中生長。多數菌株最適碳源為可溶性淀粉，PGSC5和PGSC6 2個菌株最適碳源為麥芽糖。大多數菌株最適氮源為蛋白胨，PGSC6、PGSC9 2個菌株最適氮源為牛肉膏，PGSC7菌株最適氮源為酵母膏和牛肉膏。所有參試菌株適宜菌絲生長的pH為中性或偏堿性，大多數菌株最適合的生長溫度為30 ℃，PGSC7最適合的生長溫度為25 ℃。全光照處理有利于參試菌株菌絲生長。這些結果與前人的研究結果基本一致。2011年柏鈺等[13]發現4種供試培養基中，PSA培養基是1株銀杏內生真菌最佳的培養基，其影響大小為PSA>PDA>MA>CZ，中性偏堿性條件下生長最好。2008年金文進等[14]發現在6種供試碳源中，可溶性淀粉最容易被中華羊茅內生真菌利用，其利用順序為可溶性淀粉>麥芽糖>蔗糖>葡萄糖>山梨醇>果糖。2010年鄭文龍等[15]發現在5種供試氮源中，蛋白胨最容易被產紫杉醇內生真菌EFY-21利用，其利用順序為蛋白胨>硝酸鉀>硝酸銨>硫酸銨>磷酸二氫銨。本研究還發現，30 ℃是參試菌株的最適生長溫度，光照有利于參試菌株菌絲生長。王仕玉等[16]發現齒瓣石斛內生真菌最適宜溫度為25 ℃，柏鈺等[13]發現1株銀杏內生真菌菌絲的生長幾乎不受光照條件影響。與本研究結果均有一定差異，這可能與寄主及其生長環境有關。

研究所使用的參試菌株是鏈格孢屬真菌，適應性強、分布廣泛、兼性寄生于植物[17]，部分作為植物內生真菌的鏈格孢菌可產具有抑菌活性的次生代謝產物。周兵等[18]研究證實，鏈格孢菌株產生的次生代謝產物可抑制小麥、水稻等作物上的常見病原菌。此外，鄒鳳蓮等[19]發現從番紅中分離的鏈格孢內生菌具有較強的適應性；雖然本研究結果發現各菌株之間生物學特性存在一定的差異，但總體反映出6株枇杷果皮內生真菌（鏈格孢）具有較強的環境適應能力。

本次試驗對參試菌株的最佳培養基、最佳碳源、氮源、最適溫度等基本生物學特性進行了研究，對參試菌株的工業發酵及定殖等方面還需進一步研究。

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