多抗菌素發酵動力學研究

吳剛 胡永紅 楊洋 顧鵬飛 楊文革 王春曉 丁志雯 曹崢

摘要： 通過測定菌絲體干重、多抗菌素含量和底物濃度，研究鏈霉菌NJYHWG66382發酵動力學方程。結果表明，這3個動力學模型能較好的解釋發酵試驗結果，選擇Logistic模型來描述鏈霉菌生長曲線，利用Leudeking-Piret方程描述多抗菌素合成的動力學過程，發現該鏈霉菌生產多抗菌素的發酵類型屬于部分生長偶聯型；最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的動力學規律。

關鍵詞： 多抗菌素； 發酵； 動力學模型

中圖分類號：S188 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1179-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.023

Study on Fermentation Kinetics of Polyoxins

WU Gang，HU Yong-hong，YANG Yang，GU Peng-fei，YANG Wen-ge，WANG Chun-xiao，DING Zhi-wen，CAO Zheng

（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China）

Abstract： Substrate concentration， dry cell weight and content of polyoxins were measured to establish fermentation kinetics equation of Streptomyces NJYHWG66382. It was proved that the three kinetics equations can explain the result well. Logistic model was used to describe the growth curve of streptomycete， Leudeking-Piret model was used to describe the produce of polyoxins， which showed that the process was partial coupling type growth. Then Leudeking-Piret-Like model was employed to describe the consumption of substrate. The parameters were calculated and the factors are obtained that affecting the yield of polyoxins， which could lay a theoretical foundation for expanded production of polyoxins.

Key words： polyoxins； fermentation； kinetic model

多抗菌素（Polyoxins）又被稱為多效霉素、多氧霉素、多抗霉素，為一系列結構相似的肽嘧啶核苷類抗生素[1，2]。最早由日本科研制藥株式會社在1965年從可可鏈霉菌阿蘇變種發酵液中提取得到[3]。自1965年發現至今，多抗菌素廣泛應用于防治番茄灰霉病、水稻紋枯病和梨黑斑病等植物真菌病害，對病原真菌表現出極強的抑制作用[4-8]。

發酵動力學研究是為了解在發酵進程中菌絲體的生長、代謝產物生成和底物消耗的動態平衡及內在規律，為后續放大化提供理論基礎[9，10]。迄今為止，國內外對多抗菌素發酵動力學的研究尚未見報道，因此研究多抗菌素的發酵動力學，將為多抗菌素后續規模化生產及發酵過程的調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌種是多抗菌素產生菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382，為課題組保存菌種。

培養基：①斜面培養基（g/L）：馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂15～20、pH 7。②平板培養基（g/L）：同斜面培養基。③種子培養基（g/L）：蔗糖10、酵母膏10、KH2PO4 0.2、FeSO4 0.2、CaCO3 0.3、pH 6.0。④發酵培養基（g/L）：蔗糖20、酵母膏20、KH2PO4 0.2、FeSO4 0.2、CaCO3 0.3、pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養方法[11，12] 250 mL錐形瓶中裝種子培養基50 mL，在搖瓶中接種菌株，培養溫度為28 ℃，搖床轉速180 r/min，培養48 h后接種至3 L發酵罐中進行發酵。

1.2.2 發酵罐培養 在3 L發酵罐中裝入1 L優化后的培養基，經121 ℃滅菌21 min，冷卻至室溫，接入5%種子液，溫度28 ℃，攪拌轉速180 r/min，通氣量3 L/min。

1.2.3 分析檢測方法

1）蒽酮-硫酸法測定發酵液中蔗糖含量[13，14]。

A.標準曲線。配制0.1 mg/mL標準液，蒽酮試劑。取6支比色管，加入標準蔗糖、去離子水和蒽酮試劑，搖勻，沸水浴10 min，取出，冷卻至室溫，在620 nm波長下測定吸光度A。以標準蔗糖用量為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

B.樣品測定。取1 mL發酵液，稀釋250倍，分別加入溶劑和樣品，搖勻，沸水浴10 min，取出，冷卻至室溫，在620 nm波長下測定吸光度A（以去離子水作空白對照），從標準曲線中查出蔗糖含量。

2）管碟法檢測多抗菌素含量[15]。

A.標準曲線。將標準品分別稀釋至200、800、 1 000、1 600、2 000、2 400 μg/mL不同濃度，使用管碟法（牛津杯法）測定不同濃度多抗菌素標準品的抑菌圈大小。以抑菌圈直徑（mm）為橫坐標、多抗菌素濃度（μg/mL）為縱坐標繪制標準曲線。

B.樣品測定。使用管碟法測定樣品抑菌圈大小，根據標準曲線測定多抗菌素含量。

3）測定菌絲體干重（DCW）。

取50 mL發酵液，4 ℃ 10 000 r/min，離心15 min，棄上清液，加入一定量去離子水洗滌2次，棄上清液，在80 ℃烘箱內烘干至恒重，減去離心管重量，即為菌絲體干重。

2 結果與分析

2.1 蔗糖標準曲線

根據試驗結果，繪制圖形如圖1，得到標準曲線方程為y=7.957 14x-0.010 86。結果表明，線性相關系數R2=0.999 2，線性關系良好，用此法計算蔗糖濃度較為精準。

2.2 菌體生長動力學模型

本試驗采用2種常見的菌絲體生長模型，即Logistic模型和Gompertz模型來模擬鏈霉菌菌絲體的生長情況，尋找最合適的模型。

2.2.1 Logistic模型 在描述微生物發酵過程中菌絲體的生長情況時，由比利時科學家Verhulst提出的Logistic方程[16，17]應用較為廣泛，能夠直觀的顯示在發酵過程中菌絲體的生長規律，Logistic方程為：

■=μm（1-■）X （1）

式中，X為菌絲體濃度（g/L）、Xm為最大菌絲體濃度（g/L）、t為發酵時間（d）。

發酵起始時間t=t0=0，X=X0，對（1）進行積分：

μmt=ln（■-1）+ln（■） （2）

或X=■ （3）

將試驗數據擬合（圖2），最終得出X0=0.688 7 g/L，Xm=2.903 0 g/L，μm=1.810 4 /d，R2=0.992 5，擬合較好。

2.2.2 Gompertz模型 Gompertz模型[18]用于描述微生物與時間變化之間的關系，其模型為：

■=r（ln■）X （4）

式中，X為菌絲體濃度（g/L）；Xm為最大菌絲體濃度（g/L）；r為比例系數。

對（4）式進行積分得：

X=A×exp{-exp[■（？姿-t）+1]} （5）

式中，λ為延滯期時間，即切線在x軸截距；A為漸近線值，即相對最大菌濃度（g/L）；e為常數2.718 28。

根據最小二乘法原理進行擬合，曲線見圖3，得到A=2.906 9 g/L，μm=1.731 4 /d，λ=-0.147 4 /d，相關系數R2=0.989 9，模型適用性較好。

本試驗分別引用Logistic模型和Gompertz模型來對鏈霉菌生長曲線進行模擬和描述。擬合結果表明，Logstic模型在鏈霉菌生長曲線的描述中擬合度最高。

2.3 多抗菌素合成動力學模型

采用Luededing-Piret[19]方程來描述鏈霉菌產物生成動力學模型：

■=？茁X+？琢■ （6）

式中，P為多抗菌素含量μg/mL，β、α為動力學相關系數。

發酵起始時間t=t0=0，P=P0，對（6）進行積分：

P=？琢X0（■-1）+？茁■ln1-■（1-e■）（7）

將試驗數據代入（7）式進行擬合（圖4），得出α=78.188 1，β=174.768 1，R2=0.894 2，模型的適用性良好。

通過方程擬合，得出α≠0、β≠0，發現多抗菌素發酵屬于部分生長偶聯型發酵，即菌體生長與產物合成相偶聯，在發酵的對數期與穩定期都會有產物合成。

α為菌絲體生長相關系數，因此αμX為菌絲體生長對產物的貢獻項；β為非菌絲體生長相關系數，則βX為非菌絲體生長相關項。圖5表示隨著時間的變化，菌絲體生長與非菌絲體生長項的變化規律。αμX項值從起始發酵到發酵終點均小于βX項。由此可知，菌絲體生長對多抗菌素的合成影響遠沒有非菌絲體生長因素（外界因素）對產量的貢獻大。

2.4 底物消耗動力學模型

在多抗菌素發酵的過程中，底物的消耗一般用于維持微生物菌絲體正常生命代謝、微生物細胞的生長和各種代謝產物的合成。根據物料平衡守則，其動力學模型可用類似Luededing-Piret-Like方程表示：

-■=■■+■■+msX （8）

式中，S為底物濃度g/d；Yx/s為菌絲體生長的得率系數，g細胞/g底物；Yp/s為底物用于產物積累的得率系數，g產物/g底物；m為維持菌絲體代謝系數，g底物//g細胞·d）。

發酵初始條件下，t=0，X=X0、P=P0=0、S=S0，將式3和式7代入（8）式，積分得

S=S0-（■+■）×（■-X0）-（m+ ■）×■×ln■ （9）

將試驗所得數據帶入（9）式，進行數據擬合（圖6），得到Yx/s =1.275 7×1025，Yp/s =1.567×105，m=0.888 0，R2=0.991 23，模型的適用性良好。

2.5 模型驗證

對試驗參數進行歸納見表1。在相同的發酵環境下重復進行3次試驗，測定菌絲體干重、多抗菌素生成量、蔗糖消耗量。對發酵的試驗測定值，利用（3）式、（7）式、（9）式作圖（圖7）。

2.6 模型總結

1）使用蒽酮-硫酸比色法建立蔗糖濃度的標準曲線，以此來對發酵過程中蔗糖濃度的變化進行實時測定。

2）本試驗將Logistic模型和Gompertz模型用于描述菌絲體生長曲線，從中選擇Logistic模型用于菌絲體生長的研究。利用Leudeking-Piret模型描述多抗菌素合成的動力學過程，發現該鏈霉菌生產多抗菌素的發酵類型屬于部分生長偶聯型，最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的動力學規律，結果表明這3個動力學模型均能較好的解釋發酵試驗結果，并對動力學模型參數進行了計算，為多抗菌素的放大化生產奠定相關理論基礎。模型方程為：

■-1.810 4X（1-■）■=78.188 1■+174.768 1X-■=■■=■■+0.888X

3 小結與討論

由建立的動力學模型可知，在第3天左右菌體的生長進入穩定期；由產物生成模型可知，菌絲體生長對多抗菌素貢獻小，而非菌絲體生長因素（外界因素）對多抗菌素貢獻顯著；由底物消耗模型可知，底物用于菌絲體生長的系數Yx/s遠大于底物用于產物生成的系數Yp/s，由此可知有大部分底物浪費在菌絲體生長上，而只有小部分底物參與產物合成。因此，為了降低流向菌絲體生長的能量，通過對發酵過程進行分階段培養，以提高用于產物生成的能量比率。

溫度對菌絲體生長有較大影響，溫度過高抑制菌絲體生長，溫度低，菌絲體生長緩慢。此外，溫度還會對鏈霉菌發酵生產多抗菌素造成影響。對于同一種微生物，菌絲體生長和產物合成所需的最適溫度不一定相同，而由動力學模型分析可知，菌絲體的生長對產量貢獻小，還會消耗用于產物合成部分的底物，因此，可在菌絲體生長達到一定濃度時，通過降低溫度來減慢菌絲體的生長，從而為產物的生成節約能源。在多抗菌素的合成過程中，鏈霉菌絲體內各種酶相互協同參加反應，溫度對酶的活性產生影響，采用多階段控制體系的溫度，可提高多抗菌素的產量。

參考文獻：

[1] ISONO K，NAGATSU J，KOBINATA K，et al. Studies on polyoxins， antifungal antibiotics Part I. Isolation and characterization of polyoxins A and B[J].Agric Biol Chem，1965（29）：848-854.

[2] ISONO K N，KOBINATA K. Studies on polyoxins， antifungal antibiotics Part V.Isolation and characterization of polyoxins C，D，E，F，G，H and I[J].Agric Biol Chem，1967（31）：190-199.

[3] ISONO K，ASAHI K，SUZUKI S. Studies on polyoxins，antifungal antibiotics.13. The structure of polyoxins[J]. J Am Chem Soc，1969，91（26）：7490-7505.

[4] ZHANG D，MILLER M J. Polyoxins and nikkomycins：Progress in synthetic and biological studies[J]. Curr Pharm Des，1999（5）：73-99.

[5] LI R，LIU G，XIE Z，et al. PolY，a transcriptional regulator with ATPase activity， directly activates transcription of polR in polyoxin biosynthesis in Streptomyces cacaoi[J]. Molecular Microbiology，2010，75（2）：349-364.

[6] LUO Y C，ZHANG H H，LIU Y Z，et al. An asymmetricapproach to 5-O-carbamoyl-2-epi-polyoxamic acid and the total synthesis of 2′′-epi-polyoxin J[J]. Tetrahedron-Asymmetry，2009，20（10）：1174-1180.

[7] 張海寬，周 斌.春雷霉素、多抗霉素防治番茄灰霉病田間藥效試驗[J].農藥科學與管理，2010，31（5）：48-49.

[8] 陶 寧，龔道新，楊友才，等.稻田土壤及水中多抗霉素殘留量的分析與檢測方法研究[J].分析測試學報，2012，31（6）：715-719.

[9] 王永宏，張 興.Xenorhabdus nematophila發酵動力學研究[J].生物數學學報，2007，22（2）：243-250.

[10] 儲 炬，李友榮.現代生物工藝學（上冊）[M].上海：華東理工大學出版社，2007.

[11] 胡永紅，曹 崢，楊文革，等.多效霉素研究進展[J].江蘇農業科學，2013，41（12）：1-4.

[12] 李忠福，陳亞敏.多氧霉素發酵條件的研究[J].中小企業管理與科技，2009，4（10）：233.

[13] 趙志敏，曲銘銳，馮化梅，等.用99MJ-1型蜂蜜質量檢測儀直讀測定蔗糖含量[J].齊齊哈爾師范學院學報，1999，17（l）：8-50.

[14] BALEY J E，OLLOS D F. Biochemical engineering fundamentals[M].New York：McGrawl-Hill Book Company，1996.

[15] 鐘建江，孫 力.多氧霉素B的定量分析檢測方法[P].中國專利：101302558，2008-6-26.

[16] 戚以政，汪叔雄.生化反應動力學與反應器[M].北京：化學工業出版社，1999.

[17] 張萬明，王志明，陳開陸，等.蒽酮比色法測定馬鈴薯淀粉深加工工藝廢液總糖含量的研究[J].光譜實驗室，2010，27（2）：435-439.

[18] WINSO C P. The gompertz curve as a growth curve[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1932，18（1）：1-8.

[19] YANG J S，RASA E，TANTAYOTAI P，et al. Mathematical model of Chlorella minutissima UTEX2341 growth and lipid production under photoheterotrophic fermentation conditions[J].Bioresource Technology，2011，102（3）：3077-3082.