非洲紫羅蘭轉基因過程中的抑菌分析

國會艷 郝愛平 賈園園 李繼光 張曉軍

摘要：以農桿菌介導法將白樺花發育相關基因Bp1AGL對非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl）進行遺傳轉化，通過設置單一變量研究轉基因過程中的抑菌方法。結果表明，在暗培養60 h，侵染時間為6 min，農桿菌活化菌液OD600 nm為0.5，暗培養覆蓋無菌紙膜的條件下，抑菌效果良好，轉基因效率更高。

關鍵詞：非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl）；轉基因；BplAGL；抑菌

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1301-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.054

Analysis on the Bacteriostatic Test of the Transgenic Process of African Violet

GUO Hui-yan1， HAO Ai-ping1， JIA Yuan-yuan2， LI Ji-guang1， ZHANG Xiao-jun1

（1. Department of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157012， Heilongjiang， China；

2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：Bp1AGL gene related to floral development from Betula platyphylla was introduced into African violet （Saintpaulia ionantha Wendl） by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. On this basis， the bacteriostatic methods by setting single variable in the transgenic process were studied. The results showed that the dark cultivate time was 60 hours， the infection time was 6 minutes，the OD600 nm value of agrobacterium was 0.5，and covered sterile paper film in the dark cultivation stage， bacteriostatic effect and transgenic efficiency were higher than other methods.

Key words： African violet（Saintpaulia ionantha Wendl）；transgene； BplAGL；bacteriostatic

自1983年世界上第一例轉基因煙草問世以來，植物轉基因技術發展迅猛。目前，全球試種的轉基因植物超過4 500種，種植面積達到5 870 hm2以上，其中大豆、棉花、油菜、番茄、馬鈴薯、煙草、南瓜、甜瓜等8種轉基因作物34個品種實現商品化生產[1，2]。楊郁文等[3]首次將花分生組織決定基因APETALA1轉入油菜，并且通過分子檢測和性狀觀察證明了APETALA1基因成功轉入并得到了有效表達，轉基因油菜植株生長正常，花形、花色與野生型無明顯差異，且開花期比未轉基因油菜提前近15 d。譚琳等[4]利用DNA直接導入法將含有SARS S1基因的植物表達載體pCS1導入農桿菌LBA4404中，并通過農桿菌介導的葉盤轉化法得到12株再生番茄小苗，PCR、Southern雜交檢測結果證實，有6株為轉基因植株。李司等[5]以胡蘿卜種子的下胚軸為外植體，分別將2種不同外源目的基因導入農桿菌LBA4404進行遺傳轉化，經PCR、Southern-blot和RT-PCR檢測，選取轉基因成功并正常轉錄的T1代植株分別進行有性雜交，獲取T1代雜交種子。同年秋季播種長出T2代植株，經檢測得到含有2種目的基因且蛋白表達量較高的轉基因胡蘿卜。楊光等[6]利用相同試驗體系對VvAG、VvAP3、VvFLC、VvFUL、VvFT、VvAP2、VvSOC1等7個花發育相關基因進行了亞細胞定位，這些基因在葡萄的花、果實以及營養器官中都有不同程度的表達。丁燕等[7]用RT-PCR法在柿花中擴增得到1個343 bp的片段，再利用RACE法分別獲得3′端1 096 bp和5′端411 bp的目的片段，拼接后獲得1 193 bp全長基因，命名為DkMADS1，DkMADS1基因在柿萼片、花瓣、子房中均表達，而在葉片中不表達，該基因在花器官中表達，推測其與花發育有關。

非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl），株高一般為15～30 cm，植株表面布滿絨毛。葉片基生，長圓狀心形或卵圓形，長6～7 cm，肉質，全緣，先端鈍。花單生或聚生，花徑2～3.5 cm，二唇狀，唇2裂，下唇3裂，裂片橢圓形，蒴果有毛[8]。東北林業大學林木育種實驗室構建了白樺花期時序消減文庫，確定了一些有價值的EST序列，克隆了若干有價值的基因，BplAGL即是其中之一[9]。BplAGL屬于AG亞家族的一員，BplAGL長度為1 179 bp，其中編碼區為723 bp，編碼240個氨基酸。由24～74位共51個氨基酸構成MADS-box，由89～188位共100個氨基酸構成K-box[10]。本試驗采用農桿菌介導法將BplAGL基因進行轉入非洲紫羅蘭中，設置單一變量研究試驗過程中的抑菌方法，為轉基因試驗做基礎準備工作。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲紫羅蘭組培苗，組培室培養。LBA4404工程菌，-80 ℃保存。MS液體和固體培養基，1/2MS液體和固體培養基。LB液體和固體培養基?？敲顾?、頭孢霉素、6-BA、NAA。芽誘導培養基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA。生根培養基1/2MS+1.0 mg/L NAA。

1.2 方法

1.2.1 暗培養時間篩選 選擇生長旺盛，14～15片真葉期的非洲紫羅蘭上部葉片作為轉化材料。剪掉葉片邊緣，將葉片剪成小塊（0.5 cm×0.5 cm）。將葉片轉入到農桿菌菌液中浸染6 min，輕輕攪動菌液，使葉盤和菌液充分接觸。取出葉片用無菌水洗3次，每次30 s，用滅菌的濾紙吸干。將葉面展開，正面朝上，接種在MS固體培養基上，使傷口處貼在培養基表面，加無菌紙膜覆蓋在葉片上。重復以上步驟共做4組，將4組培養皿包好，分別放于恒溫箱中23 ℃暗培養48、60、72、84 h。在芽誘導培養基中加入頭孢（終濃度為600 mg/L），卡那霉素（終濃度為50 mg/L），把暗培養平板上的葉片轉接到光培養基上，將傷口處貼在培養基表面，正面朝上。將培養皿用雙層封口膜封好，置于光照培養箱中培養（28 ℃，光照培養周期16 h/8 h），觀察所培養植物組織是否有農桿菌生長。

1.2.2 浸染時間篩選 將切好的葉盤外植體放入到農桿菌菌液中分別浸染5、6、7、8 min，輕輕晃動菌液，使葉盤和菌液充分接觸，暗培養時間均為60 h，其他步驟同上。

1.2.3 菌液OD值選擇 將葉片轉入到OD600 nm分別為0.4、0.5、0.6、0.7的4組農桿菌菌液中分別浸染6 min，輕輕攪動菌液，使葉盤和菌液充分接觸。暗培養時間均為60 h，其他步驟同上。

1.2.4 無菌紙膜的覆蓋與否 農桿菌浸染完畢后，一組將無菌紙膜覆蓋在葉片上，另一組不覆蓋無菌紙膜。暗培養時間均為60 h，其他步驟同上。

2 結果與分析

2.1 暗培養時間的確定

暗培養時間過長會使農桿菌過度生長使植物組織受到毒害而死亡；暗培養時間過短，外源基因不能充分地進入受體植株，轉化率會大大降低。因此，農桿菌與外植體的共培養時間是整個轉化過程中關鍵的一個環節。從圖1可以看出，在48 h和60 h的暗培養條件下，非洲紫羅蘭葉片周圍無農桿菌生長，說明抑菌效果較理想；在72 h和84 h的暗培養條件下，葉片周圍布滿了農桿菌，說明抑菌效果很差。因此，暗培養時間選擇為60 h，因為在沒有農桿菌生長的情況下，暗培養時間越長，農桿菌與被侵染植株共培養時間越長，外源基因進入受體植株的幾率越大，轉化率也就越高。

2.2 浸染時間的確定

農桿菌浸染時間是影響遺傳轉化率的重要因子。從圖2可以看出，浸染時間為5、6 min時非洲紫羅蘭葉片周圍無農桿菌生長；浸染時間為7、8 min時葉片周圍布滿農桿菌，說明浸染時間5～6 min抑菌效果較好，確定最佳浸染時間為6 min，因為在不長農桿菌的情況下浸染時間越長轉基因效率越高。

2.3 菌液OD600 nm的確定

合適的菌液濃度有助于提高轉化效率。菌液濃度太低，接種的葉片傷口面的農桿菌數量太少，轉化率低；菌液濃度過高，常導致農桿菌繁殖過度，對植物組織產生毒害，同樣降低轉化效率。從圖3可以看出，菌液OD600 nm在0.4和0.5時，非洲紫羅蘭葉片周圍無農桿菌生長；菌液OD600 nm在0.6和0.7時，葉片周圍布滿農桿菌，所以確定浸染時菌液最佳OD600 nm為0.5，因為在葉片周圍沒有農桿菌生長的情況下，OD600 nm越高轉化率越高。

2.4 無菌紙膜的覆蓋

農桿菌是好氧型細菌，控制其與氧氣的接觸可以抑制農桿菌的生長。圖4（A）中覆蓋無菌紙膜的非洲紫羅蘭葉片周圍無農桿菌生長；而未覆蓋無菌紙膜（B）的葉片周圍布滿農桿菌，結果表明覆蓋無菌紙膜對農桿菌的生長起到一定的抑制作用。

3 小結與討論

本試驗通過設置單一變量的方法，研究非洲紫羅蘭轉基因過程中農桿菌的抑制情況。通過試驗，初步建立了轉基因過程中較好的抑制農桿菌生長的條件：暗培養時間為60 h，浸染時間6 min，農桿菌菌液最佳OD600 nm為0.5，轉入暗培養時覆蓋無菌紙膜。

謝秀禎等[11]通過對根癌農桿菌介導的玫瑰茄細胞遺傳轉化研究得到，農桿菌菌液OD600 nm超過0.55后，不僅BplAGL基因的瞬時表達率有所降低，而且暗培養后再進行光培養外植體周圍被農桿菌包圍，最后褐化死亡。暗培養時間必須超過16 h，但如果暗培養時間過長，會因為農桿菌過度生長導致植物細胞受到毒害而死亡。由此看來，農桿菌介導法轉基因過程中的抑制農桿菌過度生長試驗直接關系到轉基因工作的成敗，所以本試驗的研究能夠為下一步BplAGL基因對非洲紫羅蘭的遺傳轉化提供一定的參考。

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