骨癌痛大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)主要組織相容復(fù)合物Ⅱ表達變化的研究

李明，耿衛(wèi)國，劉文明

（1.山東省東營市人民醫(yī)院護理部，山東東營257091；2.山東省東營市立兒童醫(yī)院，山東東營257091；3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，山東濱州256603）

骨癌痛大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)主要組織相容復(fù)合物Ⅱ表達變化的研究

李明1，耿衛(wèi)國2，劉文明3

（1.山東省東營市人民醫(yī)院護理部，山東東營257091；2.山東省東營市立兒童醫(yī)院，山東東營257091；3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，山東濱州256603）

目的建立大鼠脛骨的骨癌痛模型，觀察骨癌痛發(fā)生時脊髓背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)主要組織相容復(fù)合物Ⅱ（MHCⅡ）的表達變化情況。方法雌性SD大鼠33只，隨機分為正常組（Naive組，n=9）、假手術(shù)組（Sham組，n=12）和骨癌痛組（骨癌痛組，n=12）。骨癌痛組右側(cè)脛骨的骨髓腔內(nèi)接種Walker 256乳腺癌細(xì)胞，Sham組注射相等體積的D-Hanks液。于手術(shù)前1天及手術(shù)后3、7、10和14 d使用von-Frey絲測定手術(shù)側(cè)的機械縮爪閾值；于手術(shù)后14d采集各組（n=9）的L3～L5的右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，每3只大鼠的背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本作為一組提取總的蛋白質(zhì)，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測MHCⅡ的變化情況；于手術(shù)后14d多聚甲醛灌注Sham組（n=3）和骨癌痛組（n=3）大鼠，取L3～L5的右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)制作冷凍切片，采用免疫熒光雙標(biāo)染色觀察MHCⅡ的變化情況以及與神經(jīng)元和衛(wèi)星細(xì)胞的關(guān)系。結(jié)果手術(shù)前各組大鼠的機械縮爪閾值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；骨癌痛組在骨癌痛模型建立7 d后較基礎(chǔ)值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且顯著低于Naive組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫熒光染色顯示MHCⅡ表達于背根神經(jīng)節(jié)的衛(wèi)星細(xì)胞；同時Western blot定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨癌痛組的MHCⅡ表達水平顯著高于Naive組，而Sham組變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)的MHCⅡ表達升高，可能參與骨癌痛的外周敏化。

骨癌痛；背根神經(jīng)節(jié)；主要組織相容復(fù)合物Ⅱ；外周敏化

2015年我國預(yù)計新增癌癥患者429.2萬例，其中肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的發(fā)病率較高[1]。有資料指出，40%進展期及90%終末期的癌癥患者需要接受針對癌癥誘發(fā)性疼痛的治療[2]，其中骨癌痛（bone cancer pain，BCP）是治療的重要部分[3]。BCP作為慢性疼痛之一，通常表現(xiàn)為持續(xù)痛和爆發(fā)痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前治療手段有限。主要組織相容復(fù)合物Ⅱ（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)的重要分子，研究表明該分子也參與基礎(chǔ)痛覺感知以及慢性疼痛的發(fā)生[4-6]。脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglias，DRGs）作為外周感覺傳入的關(guān)鍵部位[7]，其在骨癌痛發(fā)生時MHCⅡ分子的表達變化情況目前尚不清楚。因此，本研究擬觀察BCP大鼠DRGs的MHCⅡ表達變化情況，為進一步探討骨癌痛的發(fā)病機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組

無特定病原（specific pathogen free，SPF）級健康成年雌性SD大鼠33只，體重200～220 g，由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院代謝與神經(jīng)精神疾病研究所提供。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±1）℃，相對濕度維持于60%，自由進水進食。隨機分為正常組（Naive組，n=9）、假手術(shù)組（Sham組，n=12）和骨癌痛組（BCP組，n=12）。

1.2骨癌痛大鼠模型制備

將Walker 256大鼠乳腺癌細(xì)胞種植于成年雌雄SD大鼠腹腔，7 d后在無菌條件下提取腹水，使用D-Hanks液反復(fù)洗滌至清亮，調(diào)整細(xì)胞濃度為4× 107個/ml，置于冰上備用。鹽酸戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射，麻醉后固定大鼠于小動物手術(shù)臺上，右后肢剃毛、消毒，沿脛骨上端前正中線縱向切開皮膚，鈍性分離肌肉筋膜等皮下軟組織，暴露脛骨粗隆，于脛骨平臺下方約0.5cm處用23G注射器針頭鉆孔至骨髓腔，針尖指向脛骨遠端，兩者間夾角約為30°。再使用20μl微量注射器沿此孔道進針，向脛骨的髓腔內(nèi)注射備用的Walker 256大鼠乳腺癌細(xì)胞10μl（約4×105個），注射完畢停留2 min，退出注射器并迅速使用骨蠟封閉針孔，沖洗手術(shù)部位，消毒皮膚，依次縫合肌肉、皮膚。Sham組大鼠脛骨髓腔內(nèi)注射相等體積的D-Hanks液。

1.3機械痛閾測定

于手術(shù)前1天以及手術(shù)后3、7、10和14 d的上午9∶00測定大鼠的機械痛閾，即機械縮爪閾值（mechanical pawwithdrawal threshold，MPWT）。MPWT測定參考文獻的方法[8]。大鼠置于獨立的玻璃箱內(nèi)（10 cm×10 cm×15 cm）適應(yīng)環(huán)境20 min后，使用校正后的系列von-Frey絲（0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和15.0g）垂直刺激大鼠右后足底中心無毛區(qū)域，起始測定值為2.0 g，持續(xù)時間大約6～8 s，每級力度重復(fù)5次，每次間隔30 s，若3次均為陽性反應(yīng)（快速縮爪、舔足）則降低一級力度測定，若為陰性則增加一級力度，如此反復(fù)進行，截斷值為15.0g。

1.4MHCⅡ免疫熒光染色

骨癌痛模型建立后14 d，Sham組（n=3）和BCP組（n=3）大鼠在鹽酸戊巴比妥鈉麻醉下解剖胸腔，行升主動脈插管，使用4℃生理鹽水300 ml和4%多聚甲醛500ml依次灌注。取L3～L5的右側(cè)DRGs，4%多聚甲醛后固定24h，再30%蔗糖脫水48h，行冷凍切片，厚度為10μm。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液漂洗5次，每次5 min，PBS稀釋的濃度為5%的牛血清白蛋白（bovine serumalbumin，BSA）封閉45 min，隨后加入小鼠抗大鼠MHCIIRT1B抗體（1∶100）與兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（美國Merck Millipore公司，商品編號：04-1062，1∶200），或者與兔抗大鼠NeuN抗體（美國Merck Millipore公司，商品編號：MABN140，1∶200），4℃孵育24h。PBS緩沖液漂洗5次，每次5min，加入Cy3-和Alexa 488-標(biāo)記的相應(yīng)山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗（美國Jackson Immuno Research公司，商品編號：115-165-003和111-545-003，1∶200和1∶100）室溫下孵育1h，PBS漂洗5 min×3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡（德國Leica公司，DM2500）下觀察并獲取圖像。

1.5蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測

在骨癌痛模型建立14 d后安樂死大鼠（n=9），取右側(cè)L3～L5的DRGs置于冰上，每3只大鼠的標(biāo)本隨機組合為一組，使用蛋白裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取組織總蛋白，分光光度法測定蛋白濃度，將50μg蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%的BSA室溫下封閉1 h，4℃孵育小鼠抗大鼠MH CclasⅡRT1B一抗（英國Ab DSerotec公司，商品編號：MCA46R，1∶1 000）和兔抗大鼠α-tubulin一抗（英國Abcam公司，商品編號：ab15246，1∶1 500）過夜，洗膜緩沖液（trisbufferedsalinewith tween-20，TBST）洗滌10min×3次，辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的相應(yīng)二抗（武漢博士德生物工程有限公司，1∶5 000）室溫下孵育1 h，再次TBST洗滌10 min×3次后使用化學(xué)發(fā)光法與HRP發(fā)生反應(yīng)，利用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)獲取條帶圖像數(shù)據(jù)并分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時間點MPWT的變化用重復(fù)測量設(shè)計方差分析，14 d后MHCⅡ蛋白表達水平的比較用隨機設(shè)計方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MPWT變化

骨癌痛模型建立前，Naive組、Sham組和BCP組大鼠肢體功能活動及感覺正常，MPWT基礎(chǔ)值在正常范圍，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在骨癌痛模型建立7 d后，BCP組大鼠MPWT較基礎(chǔ)值明顯下降（P<0.05），手術(shù)后10 d和14 d時更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與Naive組比較，BCP組在骨癌痛模型建立7、10和14d后MPWT均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Sham組大鼠在骨癌痛模型建立前后各時間點MPWT較基礎(chǔ)值無顯著變化，與Naive組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示脛骨髓腔內(nèi)種植Walker 256乳腺癌細(xì)胞能夠誘發(fā)異常疼痛，類似于骨癌痛患者的臨床表現(xiàn)，說明骨癌痛大鼠模型制作成功。見表1。

表1　各組大鼠不同時間點MPWT的變化情況（g±s）

表1　各組大鼠不同時間點MPWT的變化情況（g±s）

注：1）組內(nèi)與術(shù)前1天比較，P<0.05；2）相同時間點與Naive組比較，P<0.05；3）組內(nèi)與術(shù)前1天比較，P<0.01；4）相同時間點與Naive組比較，P<0.01

1014 Naive組（n=9）10.82±4.2512.01±4.659.88±5.219.40±2.5710.54±3.93 Sham組（n=12）10.82±4.257.86±1.519.58±5.0410.09±2.6210.05±4.81 BCP組（n=12）10.93±3.958.35±4.825.27±4.961）2）1.57±0.583）4）1.33±1.133）4）組別術(shù)前1天手術(shù)后時間/d 3 7

2.2MHCⅡ在DRGs表達的細(xì)胞類型

收集骨癌痛模型建立14d后的BCP組大鼠右側(cè)L3～L5的DRGs制作冷凍切片，通過免疫熒光雙標(biāo)觀察MCHⅡ在DRGs表達的細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)MHCⅡ與GFAP共定位，而不與NeuN共定位，提示骨癌痛病理情況下DRGs的MHCⅡ由衛(wèi)星細(xì)胞表達。見圖1。

2.3MHCⅡ蛋白表達水平在DRGs的變化情況

在骨癌痛大鼠模型建立14 d后，收集大鼠右側(cè)L3～L5的DRGs，利用Western blot方法檢測MHCⅡ的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)BCP組大鼠在手術(shù)后14d時MHCⅡ蛋白表達水平在該側(cè)L3～L5的DRGs表達較Naive組顯著升高（P<0.05），而Sham組無顯著變化。該結(jié)果提示MHCⅡ可能參與骨癌痛的病理過程。見圖2和表2。

圖1　MHCⅡ表達于BCP大鼠DGRs的衛(wèi)星細(xì)胞

圖2　各組大鼠MHCⅡ在L3～L5節(jié)段DRGs的表達情況

表2　各組大鼠MHCⅡ蛋白在L3～L5節(jié)段DRGs的相對表達量比較（g±s）

表2　各組大鼠MHCⅡ蛋白在L3～L5節(jié)段DRGs的相對表達量比較（g±s）

注：?與Naive組比較，P<0.05

組別MHCⅡ/α-tubulin蛋白的表達量F值P值Naive組1.000±0.000 Sham組1.336±0.352 BCP組3.168±0.449?37.6610.000

3 討論

近年來，多種腫瘤細(xì)胞系和動物品系被用來制備BCP動物模型[9]，以模擬BCP患者的臨床癥狀及病理生理機制，進而對BCP的發(fā)病機制進行研究，同時探索該疾病行而有效的治療方案。本研究采用成熟的BCP模型制備方法，向大鼠右側(cè)脛骨的髓腔內(nèi)注射Walker 256大鼠乳腺癌細(xì)胞，在種植7 d后該側(cè)肢體對15 g以下的系列von-Frey絲刺激（通常為無害性觸覺）表現(xiàn)異常疼痛，MPWT呈時間依賴的顯著性下降，表明骨癌痛大鼠模型制備成功。

骨癌痛發(fā)生于原發(fā)性骨骼腫瘤或其他部位惡性腫瘤（例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等）中晚期轉(zhuǎn)移至骨骼，表現(xiàn)為進行性加重的持續(xù)痛，并伴有自發(fā)痛及活動誘發(fā)痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，發(fā)病機制復(fù)雜[10]。當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生于骨骼時，一方面腫瘤及其基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并釋放致痛物質(zhì)，如緩激肽、內(nèi)皮素、神經(jīng)生長因子、IL-6、TNF-α等，它們參與敏化或直接興奮初級傳入纖維[11]；另一方面，腫瘤生長導(dǎo)致骨骼微環(huán)境的變化能夠誘發(fā)骨骼重塑，該病理性改變興奮支配骨骼的機械性壓力感受器，表現(xiàn)為爆發(fā)痛（活動誘發(fā)痛）[12]；此外，當(dāng)腫瘤細(xì)胞突破骨骼侵蝕至周圍組織時，破壞感覺纖維的遠端末梢，引起神經(jīng)病理性疼痛[13]。以上論述說明外周感覺傳入纖維的敏化在BCP的發(fā)生及維持中具有重要的作用。DRGs是外周初級感覺傳入纖維的細(xì)胞體所在，是外周敏化的關(guān)鍵部位，所以有理由認(rèn)為DRGs的系列改變能夠反映BCP發(fā)生時外周敏化的進展程度。利用逆行示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，支配脛骨的感覺纖維主要來自于L3的DRG，還有少部分來自于L1、L2、L4和L5[7]。因此，本研究中采集右側(cè)L3～L5的DRGs進行研究。

主要組織相容復(fù)合物在大鼠命名為RT1系統(tǒng)，其中MHCⅡ稱為RT1-B/D，包含有α鏈和β鏈，基因定位于大鼠的20號染色體上[14]。通常認(rèn)為MHCⅡ參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的抗原遞呈，然而新近研究發(fā)現(xiàn)編碼該分子的基因與基礎(chǔ)痛覺的感知有關(guān)[6]，甚至參與慢性疼痛發(fā)生的調(diào)控[4]，更有證據(jù)表明該蛋白分子直接與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生存在一定關(guān)系[5]。有學(xué)者報道，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞表達MHCⅡ與由外周血液趨化遷移而來的CD4+T淋巴細(xì)胞相互作用并釋放促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的中樞敏化[15]，而抑制該分子的表達能夠逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的相關(guān)疼痛行為[16]。在本研究中，筆者觀察到骨癌痛發(fā)生時大鼠DRGs的MHCⅡ表達水平上調(diào)，且定位于衛(wèi)星細(xì)胞上，據(jù)此推測MHCⅡ參與骨癌痛外周敏化的發(fā)生過程。

在此項研究中，筆者發(fā)現(xiàn)BCP大鼠的痛閾顯著降低，DRGs的MHCⅡ表達顯著升高，提示MHCⅡ可能參與BCP的外周敏化的病理過程，在未來的工作中筆者將對該分子在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平進行有效干預(yù)，進一步證實其在BCP病理過程中的作用，為BCP治療提供新的靶點。

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（張蕾編輯）

Expression of major histocompatibility classⅡin spinal dorsal root ganglions of rats with cancerous bone pain

Ming Li1，Wei-guo Gen2，Wen-ming Liu3
（1.Department of Nursing，Dongying People's Hospital，Dongying，Shandong 257091，China；2.Children Hospital of Dongying，Dongying，Shandong 257091，China；3.Department of Burn and Aesthetic Plastic，the Affiliated Hospital，Binzhou Medical University，Binzhou，Shandong 256603，China）

Objective To investigate the changes in the expression level of major histocompatibility classⅡ（MHCⅡ）in spinal dorsal root ganglions of rats with cancerous bone pain（CBP）.Methods Thirty-three adult virgin female Sprague-Dawley rats weighing 200-220 g，were randomly divided into three groups:naive group（n =9），sham group（n=12），and CBP group（n =12）.Walker 256 rat mammary carcinoma cells were inoculated into the right tibial medullary canal to establish a CBP model，whereas the same volume of D-Hanks solution was injected in the sham group.Mechanical paw withdrawal threshold（MPWT）was examined 1 day before and 3，7，10 and 14 daysafter surgery using calibrated von-Frey filaments applied to the center of ipsilateral hind paw.The L3-L5 ipsilateral dorsal root ganglions（DRGs）were collected 14 days after surgery to test the expression level of MHCⅡby Western blot and immunofluorescent staining.Results The MPWT was not significantly different among the three groups before operation.In the CBP group the MPWT significantly decreased on the 7th day after surgery（P＜0.05），and was significantly lower than that of the naive group（P ＜0.05）.The immunofluorescent staining identified that MHCⅡwas dominantly expressed by satellite cells in the DRGs of the CBP rats.Furthermore，Western blot results showed that expression level of MHCⅡwas significantly increased in the CBP group，but not in the sham group，as compared with the naive group.Conclusions The changes in the expression level of MHCⅡin satellite cells of DRGs may be involved in the development of peripheral sensitivity under CBP.

cancerous bone pain；dorsal root ganglion；major histocompatibility classⅡ；peripheral sensitivity

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.18.002

1005-8982（2016）18-0006-05

2016-01-25

劉文明，E-mail：GWG1506@sina.com