胃癌患者Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性分布變化及意義

張明明，檀碧波，趙培，于悅卿，張翠改，劉欣

(1河北省人民醫(yī)院,石家莊050051；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

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胃癌患者Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性分布變化及意義

張明明1，檀碧波2，趙培1，于悅卿1，張翠改1，劉欣1

(1河北省人民醫(yī)院,石家莊050051；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

目的探討胃癌患者外周血Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性的分布變化及意義。方法 選取350例胃癌患者作為胃癌組，同時(shí)取200例體檢健康者作為對(duì)照組。化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、鐵蛋白(FER)、糖類抗原72-4(CA72-4)水平；ELISA法檢測(cè)血清Vav1及IL-2水平；PCR法檢測(cè)外周血Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性的分布情況。對(duì)兩組患者各指標(biāo)進(jìn)行比較，并就各指標(biāo)與胃癌的關(guān)系進(jìn)行Logistic相關(guān)分析。結(jié)果 與對(duì)照組比較，胃癌組血清中Vav1、CEA、FER、CA72-4水平均升高，IL-2水平降低(P均<0.05)。外周血Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性有AA、GA、GG三種基因型。胃癌組中AA、GA的基因型頻率及A等位基因頻率均高于對(duì)照組(P均<0.05)。胃癌組和對(duì)照組按E59K基因型分組后發(fā)現(xiàn)IL-2的水平隨GG基因型、GA基因型、AA基因型逐漸降低，Vav1的水平逐漸升高(P均<0.05)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AA基因型與胃癌關(guān)系密切，是胃癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=2.67，95%CI為1.814～6.474，P=0.003)。結(jié)論 胃癌患者Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性中，以AA基因型為主，該基因型可能通過升高Vav1、降低IL-2水平，從而促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。

胃腫瘤；Vav1基因；基因多態(tài)性；E59K位點(diǎn)

胃癌早期即可能出現(xiàn)局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已成為嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，手術(shù)不能達(dá)到根治效果，化療藥物有效率也不理想[1]。胃癌發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中遺傳因素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2～4]。白細(xì)胞介素2(IL-2)作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，刺激免疫細(xì)胞生長、增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用[5, 6]。研究證明，IL-2能誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞毒活性，單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)合已廣泛用于腫瘤治療[7]。Vav1基因具有原癌基因特征，能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[8]。E59K突變是發(fā)生在Vav1蛋白CH區(qū)域的突變，有研究證實(shí)，該突變與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)。但該突變與胃癌之間相關(guān)性的報(bào)道少見。還有研究證實(shí)，Vav1可以調(diào)節(jié)IL家族成員表達(dá)，而胃癌患者Vav1基因多態(tài)性與IL-2的關(guān)系也尚無報(bào)道。本文中，我們檢測(cè)了胃癌患者與正常人外周血中的Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性分布，同時(shí)探討了IL-2與Vav1基因突變之間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2012年7月～2015年12月在河北省人民醫(yī)院腫瘤科及河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普外科確診的胃癌患者350例(胃癌組)，均由術(shù)前活檢和術(shù)后病理檢查確診。其中男207例、女143例，年齡28～76歲。患者均為首次就診，未接受過其他任何治療。同時(shí)選取200例同期來本院查體的健康人作為對(duì)照組，男118例、女82例，年齡31～77歲。排除腫瘤家族史、胃炎、胃食管反流征等疾病。兩組性別、年齡有可比性。

1.2標(biāo)本采集晨起抽取空腹靜脈血7 mL。5 mL放入促凝管中，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離血清，用于腫瘤標(biāo)志物及炎癥因子的檢測(cè);2 mL采用 EDTA-K2抗凝，顛倒混勻，用于基因組DNA的提取。

1.3血清癌胚抗原(CEA)、鐵蛋白(FER)、糖類抗原72-4(CA72-4)的測(cè)定應(yīng)用i2000化學(xué)發(fā)光儀(美國雅培公司)測(cè)定血清CRA、FER、CA72-4水平。試劑為羅氏(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.4血清Vav1、IL-2水平的測(cè)定采用ELISA法。Vav1試劑盒(ELISA-015925，R﹠D Systems公司，美國)檢測(cè)范圍：9.3～300 ng/mL，人IL-2試劑盒(Human Interleukin ELISA Kit， ELISA-01016，R﹠D Systems公司，美國)檢測(cè)范圍：7.8～500 pg/mL。嚴(yán)格依據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.5外周血Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性分析采用PCR法。①提取基因組DNA：EDTA-K2抗凝血400 μL，按照TIANamp Genomic DNA kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，DP304)說明書提取基因組DNA。②PCR擴(kuò)增靶基因片段：應(yīng)用生物學(xué)軟件Primer6.0設(shè)計(jì)特異性上下游引物，并將引物序列與GenBank進(jìn)行比對(duì)。引物序列:上游5′-GCCCTGGGCAGGCGGTAGCC-3′，下游5′-GACCCCCGTCTCCAACCCTC-3′。在生物安全柜(青島海爾，HR40-11A2)中制備反應(yīng)體系：1×PCR緩沖液，2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP(dUTP∶dTTP=1∶9)，200 μmol/L上下游引物，DNA聚合酶(eurobio)2.5 U Taq，不耐熱的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG；羅氏)1 U，目標(biāo)DNA 5 μL，加無菌水制成反應(yīng)體系50 μL。20 ℃孵育10 min使UNG 裂解U-DNA。在Eppendorf Mastercycler nexus PCR分析儀設(shè)置循環(huán)程序，初始變性步驟：95 ℃，10 min。PCR在擴(kuò)增儀進(jìn)行35次循環(huán)(95 ℃，變性30 s；59 ℃，退火30 s；72 ℃，擴(kuò)增30 s)，最后72 ℃孵育10 min。擴(kuò)增的靶基因產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析驗(yàn)證，DL500 TM DNA Marker(Takara)為分子標(biāo)記物。③核苷酸序列分析：將驗(yàn)證后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后在美國ABI 3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀上直接測(cè)序。為保證測(cè)序結(jié)果的可靠性，采用雙向測(cè)序。測(cè)定結(jié)果用DNAMAN軟件(V6.0.3.99漢化版)與GenBank、EMBL、DDBJ數(shù)據(jù)庫中Vav1基因序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果與基因庫基因序列之間的差異，判斷突變位點(diǎn)的位置，確定突變位點(diǎn)。

2　結(jié)果

2.1胃癌組和對(duì)照組血清Vav1、IL-2、CEA、CA72-4、FER水平比較見表1。

2.2Vav1基因E59K位點(diǎn)多態(tài)性Vav1基因E59K位點(diǎn)存在兩種單核苷酸G和A，共有3種基因型：AA(突變純合子)、GA(突變雜合子)、GG(野生型)。

表1　兩組血清Vav1、IL-2、CEA、CA72-4、FER水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3兩組Vav1基因E59K位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較見表2。

表2　兩組Vav1基因E59K位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4兩組E59K突變位點(diǎn)不同基因型間IL-2、Vav1水平比較見表3。

表3　兩組E59K突變位點(diǎn)不同基因型間IL-2、Vav1水平比較

注：與同組GG基因型比較，*P<0.05；與同組GA基因型比較，#P<0.05。

2.5胃癌與各觀察指標(biāo)的相關(guān)性以是否患有胃癌(無=0，有=1)為因變量，以性別(男=1，女=2)、年齡(<40歲=0,40～50歲=1,51～60歲=2,61～70歲=3,>71歲=4)、IL-2、CEA、CA72-4、FER、Vav1基因E59K基因型(GG=0，GA=1,AA=2)為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示基因型，尤其是AA基因型與胃癌關(guān)系密切，是胃癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=2.67，95%CI1.814～6.474，P=0.003)。

3　討論

胃癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，腫瘤細(xì)胞生長迅速，并向周圍侵襲或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，很難實(shí)現(xiàn)臨床根治。雖然胃癌的治療已取得進(jìn)展，但術(shù)后生存率仍低。因此尋找能準(zhǔn)確判斷腫瘤狀態(tài)的指標(biāo)對(duì)于胃癌綜合診治有重要意義。已有研究證實(shí)，Vav1在多種腫瘤中表達(dá)明顯增高，具有促進(jìn)腫瘤生長、擴(kuò)散、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用[8]，但Vav1與胃癌關(guān)系的研究少見。本研究檢測(cè)了患者血清Vav1水平，結(jié)果顯示胃癌組血清Vav1水平明顯高于對(duì)照組，由此可見，血清Vav1的水平高低與胃癌腫瘤組織存在密切關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)按Vav1基因E59K位點(diǎn)GG、GA、AA基因型的順序，Vav1的水平依次升高。由此推測(cè)Vav1基因E59K突變可能影響了Vav1蛋白表達(dá)。

Vav1基因位于19號(hào)染色體，全長84 699 bp，共有26個(gè)外顯子，26個(gè)內(nèi)含子，E59K突變是第1外顯子中的315位堿基由原來的鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，使其編碼的氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷Ｔ撏蛔兾挥贑H結(jié)構(gòu)域的編碼基因區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域正常狀態(tài)時(shí)使蛋白處于失活狀態(tài)，突變發(fā)生后該結(jié)構(gòu)域功能喪失，出現(xiàn)蛋白異常表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，胃癌組和對(duì)照組均檢出GG、GA、AA三種基因型，胃癌組Vav1基因GA、AA基因型頻率和A等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組，表明Vav1基因E59K位點(diǎn)突變可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。

IL-2主要由活化的CD4+Th1細(xì)胞產(chǎn)生，生物活性廣泛，可促進(jìn)Th、CTL、B細(xì)胞的增殖、分泌，激活巨噬細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起調(diào)控作用。本研究中胃癌組IL-2 的水平明顯低于對(duì)照組。胃癌組和對(duì)照組中GG基因型、GA基因型、AA基因型的IL-2水平依次降低。由此推測(cè)，Vav1基因E59K突變可能影響了IL-2的水平。本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌組腫瘤標(biāo)志物FER、CEA、CA72-4的水平均明顯高于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。為進(jìn)一步判斷Vav1基因E59K突變?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展中的作用，本研究進(jìn)行了Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，AA基因型與胃癌關(guān)系密切，是胃癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Vav1基因E59K突變與胃癌有關(guān)，該位點(diǎn)突變可能通過促進(jìn)Vav1在患者體內(nèi)的表達(dá)并降低IL-2水平，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。

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Distribution changes of Vav1 gene E59K site polymorphism in patients with gastric cancer

ZHANGMingming1,TANBibo,ZHAOPei,YUYueqing,ZHANGCuigai,LIUXin

(1HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the distribution changes of Vav1 gene E59K site polymorphism in the periphreal blood of patients with gastric cancer and its significance.MethodsTotally 350 cases of patients with gastric cancer were selected as the gastric cancer group, and 200 cases of healthy people were recruited as the control group. The levels of CEA, FER and CA72-4 were detected in peripheral blood by chemiluminescence. The levels of Vav1 and IL-2 were tested with ELISA. PCR was applied to test E59K site polymorphism of Vav1 gene in the peripheral blood. The various indexes were compared between the two groups, and the relationships of each index with gastric cancer were analyzed. Results Compared with the control group, the levels of Vav1, CEA, FER and CA72-4 in the peripheral blood were higher, whereas the level of IL-2 was lower in the gastric cancer group (allP<0.05). Three kinds of genotypes AA, GA and GG were found for E59K site polymorphism of Vav1 gene. The frequencies of genotypes AA and GA and allelic gene A in the gastric cancer group were higher than those of the control group (allP<0.05). The level of IL-2 gradually decreased in genotypes GG, GA and AA, and the level of Vav1 gradually increased in genotypes GG, GA and AA in the gastric cancer group and the control group (allP<0.05). Logistic regression analysis showed that genotype AA was closely related with progress of gastric cancer, which was an independent risk factor for gastric cancer (OR=2.67, 95%CI: 1.814-6.474,P=0.003). ConclusionIn the Vav1 gene E59K site polymorphism of patients with gastric cancer, genotype AA is mainly found, which might promote the occurrence and development of gastric cancer by increasing Vav1 expression and decreasing IL-2 expression.

stomach neoplasms; Vav1 gene; gene polymorphism; E59K site

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20150131)。

張明明(1976-)，女，博士，副主任檢驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤基因突變檢測(cè)的研究。E-mail: zhangmm197612@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.004

R735.2

A

1002-266X(2016)29-0011-03

2016-04-25)