L-茶氨酸對產腸毒素大腸桿菌引起的免疫應激小鼠腸道的保護作用研究

劉遵瑩，劉秋玲，鄧燕莉，陳凌，肖文軍,3*

?

L-茶氨酸對產腸毒素大腸桿菌引起的免疫應激小鼠腸道的保護作用研究

劉遵瑩1,2，劉秋玲1,2，鄧燕莉1,2，陳凌1,2，肖文軍1,2,3*

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128；2. 湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙 410128；3. 湖南農業大學湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南長沙 410128

以SPF級Balb/c雌性小鼠為實驗動物，對其適應性飼養3?d后連續30?d灌喂不同劑量L-茶氨酸，然后腹腔注射產腸毒素大腸桿菌E44813誘導免疫應激，5?h后取樣，分析研究了L-茶氨酸對小鼠體重，回腸組織谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）、過氧化氫酶（Homogenate catalase, CAT）與誘導型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase, iNOS）活性，丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量、空腸組織病理學變化，以及血清腫瘤壞死因子α （Tumor necrosis factor-α, TNF-α）、細胞間粘附分子1（Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1）和白介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）表達量的影響，以探明L-茶氨酸對產腸毒素大腸桿菌免疫應激小鼠腸道的保護作用。結果表明，各劑量L-茶氨酸均能顯著增加小鼠體重，可減輕產腸毒素大腸桿菌E44813引起的腸道組織病變程度，升高回腸組織GSH-Px和CAT酶活性，降低MDA含量和iNOS酶活性，在不同程度上抑制血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表達量。說明L-茶氨酸可通過抑制炎性細胞因子表達水平、降低脂質過氧化程度和提高抗氧化能力來維護腸道組織形態與結構的完整性，并達到保護腸道的作用。

L-茶氨酸；產腸毒素大腸桿菌；免疫應激；保護腸道

腸道不僅是消化吸收和交換營養物質的重要場所，也是保護機體免受各種病菌和毒素侵染的重要免疫器官[1-2]。產腸毒素大腸桿菌（，ETEC）是一類常見的致人和幼畜腹瀉的人畜共患型病原體，可通過黏附素結合到小腸黏膜上皮細胞，然后在腸道內大量增殖，產生一種或多種腸毒素，進而引起小腸分泌大量液體從而導致腹瀉[3-4]。長期或大量使用復合抗生素不僅使ETEC產生耐藥性和變異，而且造成抗生素低效和在體內累積，導致胃腸道菌群紊亂，引發多種疾病[5]。因此，尋找天然、安全、有效的植物功能成分來替代抗生素是未來防治大腸桿菌感染、保護腸道健康的重要發展方向[6-8]。

L-茶氨酸（L-Theanine）是茶葉中的特征性氨基酸[9]，經口攝入后在小腸黏膜刷狀緣經鈉離子依賴的轉運體轉運入血而被運輸到各個組織器官中[10]。L-茶氨酸具有安全、穩定等優點，能夠促進生長、保護神經、提高抗氧化能力和免疫力等生物活性[11-19]，但尚未見L-茶氨酸對產腸毒素大腸桿菌引起的免疫應激小鼠腸道保護作用的研究報道。本研究以SPF級Balb/c雌性小鼠為實驗動物，采用L-茶氨酸預防干預，再腹腔注射產腸毒素大腸桿菌E44813，研究L-茶氨酸對產腸毒素大腸桿菌免疫應激小鼠腸道的保護作用，為L-茶氨酸的深層開發利用及臨床大腸桿菌感染病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-茶氨酸（≥98%）購于德國sigma試劑公司；產腸毒素大腸桿菌菌株O78：K80（44813）即E44813由中國食品藥品檢定研究院提供；地塞米松片（批號：140911，天津藥業集團新鄭股份有限公司）；HyClone磷酸鹽緩沖液（批號：211362，北京博艾爾科技有限公司）；氯化鈉注射液（批號：1410032704，石家莊鵬海制藥有限公司）；乙醇、乙酸（國藥集團化學試劑有限公司）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、小鼠細胞間粘附分子1（ICAM-1）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、過氧化氫酶（CAT）可見光試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器設備

多功能酶標儀（美國Thermo公司）；96孔酶標板（深圳金燦華實業有限公司）；冷凍離心機（美國Thermo公司）；Starorius精密電子天平（瑞士Starorius公司）；系列量程移液槍（德國Eppendorf公司）；恒溫搖床（江蘇蘇昆公司）；DSY-2-8 水浴鍋（北京國華醫療器械廠）；NanoDrop 2000/2000c分光光度儀（Thermo Scientific，德國）。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗設計

Balb/c小鼠，SPF級，雌性，6~8周齡，19~21?g，60只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產單位許可證編號：SCXK（湘）2011-0003，實驗動物質量合格證編號：43004700009227，接受日期：20141009。動物飼養于湖南農業大學茶葉研究所，溫度（22±2）℃，濕度40%~60%，光照：12?h明、12?h暗，通風：≥15次·h-1全新風。小鼠購回后于動物房適應性飼養3?d，期間自由飲水進食。

小鼠適應性喂養結束后，按平均體重分為6組，每組10只，分別為正常對照組（Control組）、免疫模型組（ETEC組）、L-茶氨酸低劑量組（L.L組）、L-茶氨酸中劑量組（L.M組）、L-茶氨酸高劑量組（L.H組）、地塞米松對照組（DEX組）。所有劑量處理組按體重給藥，L.H組、L.M組和L.L組分別給予L-茶氨酸500、300、100?mg·kg-1·d-1；DEX組給予地塞米松5?mg·kg-1·d-1，Control組與ETEC組給予相同劑量生理鹽水，按上述試驗方法連續灌喂30?d。第31天采用產腸毒素大腸桿菌E44813造模，造模前禁食6?h，用1?mL無菌注射器腹腔注射E44813，劑量為0.02? mL·g-1，Control組腹腔注射生理鹽水0.02? mL·g-1。

1.3.2 取樣及樣品分析

按小鼠分組和體重給藥，連續灌喂30?d，分別在第1天、第8天、第15天、第22天和第29天記錄小鼠體重。E44813造模5?h后取樣。小鼠摘眼球采血，常溫靜置2?h，3?500?r·min-1離心10?min取上清，用ELISA試劑盒檢測各處理組小鼠血清中TNF-α、ICAM-1和IL-1β的表達量。脫頸椎處死取腸道組織，取空腸末端2?cm放入10%中性甲醛中固定用于HE染色，觀察小鼠空腸組織的病變情況。取回腸組織約100?g研磨后置于生理鹽水中制備10%的回腸組織勻漿，用于檢測各處理組小鼠回腸GSH-Px、CAT、MDA和iNOS活性。

1.3.3 統計分析方法

2 結果與分析

2.1 L-茶氨酸對小鼠體重變化的影響

不同劑量L-茶氨酸對小鼠飼養過程中體重變化的影響如表1所示。連續灌喂過程中正常對照組、免疫模型組、L-茶氨酸各劑量組小鼠體質量均增加，且L-茶氨酸各劑量組與正常對照組之間均有顯著性差異（＜0.05），其中L-茶氨酸中劑量組小鼠體質量的增加量顯著高于L-茶氨酸低劑量組和L-茶氨酸高劑量組。地塞米松對照組與正常對照組相比，小鼠體重下降，這可能是由于地塞米松作為一種治療型的抗炎藥物，對正常小鼠腸道吸收與消化營養物質有影響所致。

表1 不同劑量L-茶氨酸對小鼠飼養過程中體重變化的影響（n=10）

注：*：與control組比較，<0.05；#：與L.M組比較，<0.05。

Note: *: Compared with control,<0.05. #: compared with L.M,<0.05.

2.2 L-茶氨酸對小鼠血清中細胞因子表達水平的影響

由圖1可知，與正常對照組相比，免疫模型組小鼠血清中TNF-α含量顯著增加（＜0.05），不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中TNF-α含量較免疫模型組顯著降低（＜0.05）；與正常對照組相比，免疫模型組小鼠血清中IL-1β含量顯著增加（＜0.05），不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中IL-1β含量較免疫模型組均降低，其中中、高劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間有顯著性差異（＜0.05）。

注：1：正常對照組；2：免疫模型組；3：L-茶氨酸低劑量組；4：L-茶氨酸中劑量組；5：L-茶氨酸高劑量組6：地塞米松對照組。與正常對照組比較，*：P<0.05；與免疫模型組比較，#：P<0.05，下同。

L-茶氨酸對小鼠血清中ICAM-1表達量的影響見圖2。從圖中可以看出，與正常對照組相比，各處理組小鼠血清中ICAM-1表達量顯著增加（＜0.05），不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中ICAM-1表達量較免疫模型組均降低，其中低、中劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間差異顯著（＜0.05）；高劑量L-茶氨酸組ICAM-1表達量高于低、中劑量L-茶氨酸組的表達量，這可能是因為L-茶氨酸劑量過高，對機體造成輕微的損傷，促進了血清中ICAM-1的表達水平。因此，一定劑量范圍內的L-茶氨酸對小鼠血清中細胞因子的表達具有抑制作用。

2.3 L-茶氨酸對免疫應激小鼠腸道組織病理的影響

各處理小鼠空腸組織切片見圖3。從圖中可以看出，正常對照組小鼠空腸組織腸黏膜結構完整，層次分明，腸黏膜上皮細胞的輪廓清晰，排列規則。免疫模型組小鼠空腸黏膜組織結構病理改變明顯，黏膜上皮受損，部分上皮細胞脫落，固有層裸露，黏膜層、黏膜下層及肌層大量淋巴細胞等炎性細胞浸潤和充血較為嚴重，并且大范圍水腫。地塞米松對照組和L-茶氨酸各劑量處理組空腸組織病變程度較輕，其中，L-茶氨酸中劑量組病變程度最輕，高劑量組次之，黏膜層、黏膜下層及肌層輕度炎性細胞浸潤和充血，僅局部水腫，說明L-茶氨酸能夠減輕ETEC引起的空腸組織病變。

注：1：正常對照組；2：免疫模型組；3：L-茶氨酸低劑量組；4：L-茶氨酸中劑量組；5：L-茶氨酸高劑量組6：地塞米松對照組。

2.4 L-茶氨酸對小鼠回腸組織酶活性的影響

各處理組小鼠回腸組織GSH-Px和CAT酶活性如圖4所示。與正常對照組相比，免疫模型組小鼠回腸組織中GSH-Px和CAT活性均降低；不同劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織中GSH-Px和CAT活性較免疫模型組均增加，其中，中、高劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間均具有顯著性差異（＜0.05），低劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間無顯著性差異。因此，L-茶氨酸具有提高小鼠回腸組織GSH-Px和CAT活性的作用。

各處理組小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性如圖5所示。與正常對照組相比，免疫模型組小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性均升高，不同劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織中MDA含量較免疫模型組均下降，其中低、中劑量組與免疫模型組之間有顯著性差異（＜0.05）；低、中劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織iNOS活性低于免疫模型組，高劑量L-茶氨酸組的高于免疫模型組，且低、中劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間有顯著性差異（＜0.05）。與免疫模型組比較，高劑量L-茶氨酸對小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性均無顯著影響，這可能是因為L-茶氨酸劑量過高，對機體造成輕微的損傷，削弱了其抑制腸道MDA含量和iNOS活性的作用。可見，在一定的劑量范圍內，L-茶氨酸具有降低小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性的作用。

3 討論

ETEC感染腸道后與腸道上皮細胞受體結合，隨后通過信號轉導引發宿主細胞的蛋白磷酸化等作用，使ETEC定殖并大量生長繁殖，大量毒素持續不斷地釋放到腸腔內，超出腸道自身免疫調節能力范圍，引起Cl-、Na+、HCO3-和水在小腸內的分泌量大量增加，從而導致腹瀉，并且細胞會釋放多種細胞因子，如TNF-α、IL-1β和ICAM-1等。若大量細胞因子持續釋放則會導致炎癥擴大和加重，腸腔內液體的過量分泌導致脫水及代謝性酸中毒等，使腸道黏膜組織損傷、脫落，進而糜爛，嚴重影響腸道吸收功能和免疫功能[20-21]。

從研究結果中不難看出，以L-茶氨酸干預小鼠，能顯著增加小鼠體重，并以中劑量最佳；對小鼠腹腔注射產腸毒素大腸桿菌E44813后，小鼠空腸組織結構受損、炎性細胞浸潤和充血等病變情況嚴重，其血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1表達量以及回腸組織勻漿MDA含量和iNOS活性顯著升高，而GSH-Px和CAT活性顯著降低，說明ETEC感染造成小鼠腸道抗氧化能力下降、炎癥反應劇烈，嚴重損傷腸道。各劑量L-茶氨酸均能減輕E44813引起的空腸組織病變，且能降低TNF-α、IL-1β、ICAM-1表達量以及MDA含量和iNOS活性，升高GSH-Px和CAT活性，并也以300?mg·kg-1劑量最佳，說明L-茶氨酸可通過抑制炎性細胞因子表達水平、降低脂質過氧化程度和提高抗氧化能力等途徑，保護由產腸毒素大腸桿菌感染所致免疫應激小鼠腸道組織形態與結構的完整性，并達到保護腸道的作用。

參考文獻

[1] Sonnenburg J L, Angenent L T, Gordon J I. Getting a grip on things: how do communities of bacterial symbionts become established in our intestine [J]. Nature Immunology, 2004, 5(6): 569-573.

[2] 王其洲, 周元軍, 黃勝昌, 等. 人獸共患病及其防治[J]. 醫學動物防制, 2005, 21(9): 675-676.

[3] Qadri F, Svennerholm A M, Faruque A S G, et al. Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention [J]. Clinical microbiology reviews, 2005, 18(3): 465-483.

[4] GiIIigan P H.EAEC, EHEC, EIEC, ETEC [J]. Clinics in laboratory medicine, 1999, 19(3): 505-521.

[5] 王星, 覃宗華, 劉定發. 大腸桿菌不耐熱腸毒素的分子生物學及黏膜免疫佐劑效應[J]. 廣東畜牧獸醫科技, 2005, 30(4): 18-21.

[6] 李成洪, 王孝友, 楊睿. 植物提取物飼料添加劑對生長豬生產性能的影響[J]. 飼料工業, 2012, 33(17): 14-16.

[7] 衛智權, 閻莉, 鄧家剛. 芒果苷對脂多糖誘導的慢性炎癥大鼠MAPK通路及血清細胞因子的影響[J]. 中草藥, 2013, 44(1): 52-58.

[8] 宋丹, 張立艷, 白換力. 香芪湯及其有效成分對LPS誘導的巨噬細胞MAPK信號通路的影響[J]. 中國獸醫學報, 2013, 33(5): 776-779.

[9] Juneja L R, Chu D C, Okubo T, et al. L-theanine-a unique amino acid of green tea and its relaxation effect in humans [J]. Trends in Food Science & Technology, 1999, 10(6): 199-204.

[10] Kitaoka S, Hayashi H, Yokogoshi H, et al. Transmural potential changes associated with theabsorption of theanine in the guinea pig intestine [J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1996, 60(11): 1768-1771.

[11] Nishida K, YasudA E, Nagasawa K, et al. Altered levels of oxidation and phospholipase C isozyme expression in the brains of theanine -administered rats [J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2008, 31(5): 857-860.

[12] 文慧, 魏時來, 張石蕊, 等. L-茶氨酸對黃羽肉雞生產性能和免疫功能的影響[J]. 動物營養學報, 2012, 24(10): 1946-1954.

[13] 孫浪, 魯雙慶, 肖調義, 等. 飼料中添加茶氨酸對草魚免疫和血清生化指標的影響[J]. 飼料研究, 2012(6): 63-65.

[14] 譚俊峰, 林智, 李靚. 茶氨酸復合制劑增強免疫力的功能研究[J]. 茶葉科學, 2012, 32(3): 224-228.

[15] 王慶利, 張力軍, 吳明春. 茶氨酸對腦缺血損傷大鼠自由基代謝的影響[J]. 實用醫學雜志, 2008, 24(11): 1898-1900.

[16] 劉婉如. 茶氨酸神經保護作用的體外和體內實驗研究[D]. 北京: 中國疾病預防控制中心, 2007: 14-62.

[17] 張燕輝, 吳明春, 王慶利. 茶氨酸對大鼠局灶性腦缺血性損傷后炎性細胞因子表達的影響[J]. 中國臨床神經外科雜志, 2010, 15(9): 544-546.

[18] De Roux N, Genin E, Carel J C, et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSSl-deftved peptide receptor GPR54 [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(19): 10972-10976.

[19] Borzelleca JF, Peters D, Hall W. A 13-week dietary toxicity and toxicokinetic study with L-theanine in rats [J]. Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(7): 1158-1166.

[20] Inoue T, Tsuji T, Koto M, et al. Amino acid sequence of heat-labile enterotoxin from chicken enterotoxigenic Escherichia coli is identical to that of human strain H 10407 [J]. FEMS Microbiology Letters, 1993, 108(2): 157-162.

[21] 陳培富, 朱興全. 大腸桿菌耐熱腸毒素的結構與特性[J]. 中國預防獸醫學報, 2012, 34(3): 244-246.

Study on the Protective Effect of L-Theanine on the Intestinal in Mice with Immune Stress Induced by ETEC

LIU Zunying1,2, LIU Qiuling1,2, DENG Yanli1,2, CHEN Ling1,2, XIAO Wenjun1,2,3*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

SPF grade Balb/c female mice were used as experimental animals. After adaptive feeding for 3 days, mice were orally pre-treated with different dosages of L-theanine once daily for 30 days before ETEC E44813 intraperitoneal injection. The body weight change in mice was analyzed during the breeding process. Mice were scarified 5 hours after ETEC injection and tissues were collected for analysis. The activities of ileum Glutathione peroxidase (GSH-Px), homogenate Catalase (CAT), Malondialdehyde (MDA) and Inducible nitric oxide synthase (iNOS) were measured and the pathological changes of intestinal and the levels of serum Tumornecrosisfactor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β) and Intercellular cell adhesion moleculeICAM-1) were examined. This study was aimed to explore the protective effects of L-theanine on intestinal of ETEC-induced immune stress model in mice. The results showed that: pretreatment with L-theanine at different dosages significantly increased mouse body weight; lowered the levels of ileum homogenate MDA and iNOS, improved the activities ofileum homogenate CAT, GSH-Px, decreased the expressions of serum TNF-α、IL-1β and ICAM-1, and improved pathological structure of jejunum tissue. These data demonstrated that pre-treatment with L-theanine prevented ETEC-induced intestinal injury through inhibiting TNF-α、IL-1β and ICAM-1, and inflammatory reaction and enhancing intestinal antioxidant abilities.

L-theanine,, immune stress, intestinal protection

Q51；Q939.1

A

1000-369X（2016）05-469-08

2016-03-24

2016-06-18

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAD10B00）

劉遵瑩，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用研究。

xiaowenjun88@sina.com