L-茶氨酸對產腸毒性大腸桿菌引起的免疫應激小鼠肝臟的保護作用研究

劉秋玲，龔志華，陳凌，劉遵瑩，鄧燕莉，陳棟，肖文軍,3*

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L-茶氨酸對產腸毒性大腸桿菌引起的免疫應激小鼠肝臟的保護作用研究

劉秋玲1,2，龔志華1,2，陳凌1,2，劉遵瑩1,2，鄧燕莉1,2，陳棟1，肖文軍1,2,3*

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙410128；2. 湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙410128；3. 湖南農業大學湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南長沙410128

以SPF級Balb/c雌性小鼠為實驗動物，對其適應性飼養3?d后連續30?d灌喂不同劑量L-茶氨酸，然后腹腔注射產腸毒性大腸桿菌E44813誘導免疫應激，5?h后取樣，分析研究了各組小鼠肝臟與脾臟系數，血清谷丙轉氨酶（Alanine aminotranferease, ALT）與谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase, AST）含量，肝組織勻漿丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平與谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-PX）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性，肝組織病理學變化，以及血清中γ-干擾素（γ-Interferon, IFN-γ）、白細胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）的表達量，以探明L-茶氨酸對產腸毒性大腸桿菌免疫應激小鼠肝臟的保護作用。結果表明，不同劑量的茶氨酸干預處理均能明顯降低由大腸桿菌E44813感染引起的肝臟、脾臟系數的升高，降低血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA水平，提高肝組織勻漿SOD、CAT、GSH-PX活性，減少IFN-γ、IL-4表達量，改善肝臟組織病理損傷，其中以300?mg·kg-1劑量組效果最好，說明茶氨酸干預對產腸毒性大腸桿菌誘導的免疫應激小鼠肝損傷具有保護作用，而且可能是通過減少IFN-γ與IL-4的表達、降低炎癥反應、提高抗氧化能力等途徑達到保護肝臟的作用。

L-茶氨酸；產腸毒性大腸桿菌E44813；免疫應激；肝臟保護

大腸埃希菌（），俗稱大腸桿菌，存在于人和動物腸道，屬正常菌叢。當宿主免疫力下降或大腸桿菌侵入腸外組織時，可引起腸外感染。產腸毒性大腸桿菌（ETEC），是發展中國家嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要病原菌，由食入被污染的食物或水而感染，主要居留于小腸近端，產生腸毒素而致病，也可引起家畜和動物大腸桿菌病（Colibacillosis）或腹瀉[1]。全球每年因ETEC感染的病例高達6.5億人次以上，導致30萬至50余萬5歲以下兒童死亡[2-3]。ETEC引起的動物疾病同樣嚴重影響全球畜牧業生產和發展[4]。多年來，復合抗生素的使用在一定程度上能夠治療大腸桿菌感染引起的疾病，同時也導致多種耐藥性ETEC菌株不斷產生并迅速傳播擴散，造成抗生素低效并在動物體內的蓄積，引發機體抵抗力下降，易繼發或并發多種疾病，因此毒副作用小、不易產生耐藥性的生物活性物質的開發利用是未來預防和防治大腸桿菌感染的重要趨勢。

L-茶氨酸是茶葉中特征性游離氨基酸，具有增強抗腫瘤藥物藥效[5-8]、增強記憶[9]、抗衰老[10]、緩解抑郁[11-12]、保護心腦血管[13-14]、抗疲勞[15]、降壓安神[16]等多種生物活性，已被人們廣泛認可。肝臟是機體物質與能量代謝的重要器官，同時也是重要的免疫器官，在抵抗細菌感染方面具有重要作用，有研究表明L-茶氨酸對酒精性肝損傷具有一定的保護作用[17]，但對免疫性肝損傷的保護作用未見文獻報道。本研究以SPF級Balb/c雌性小鼠為實驗動物，采用L-茶氨酸預防干預，再腹腔注射產腸毒性大腸桿菌E44813，研究L-茶氨酸對產腸毒性大腸桿菌免疫應激小鼠肝臟的保護作用，為Ｌ-茶氨酸的深層開發利用及臨床大腸桿菌感染病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設備

1.1.1材料

L-茶氨酸：純度≥98%，購于德國sigma試劑公司。

產腸毒性大腸桿菌E44813菌種：由國家植物功能成分利用工程技術研究中心保存。

1.1.2試劑

干擾素-γ（IFN-γ）ELISA試劑盒、白細胞介素4（IL-4）ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。

天門冬氨酸轉移酶（AST）、丙氨酸轉移酶（ALT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器設備

多功能酶標儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司），MIKRO22R 型臺式冷凍離心機（德國 Hettich 公司），紫外分光光度計UV-2550（日本島津公司），壓力蒸汽滅菌鍋（上海中安醫療器械廠），電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1動物實驗設計

SPF級Balb/c雌性小鼠，每只小鼠體質量（21±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼料亦購于該公司，飼養條件為：環境溫度20~25℃，相對濕度50%~70%，12?h光照。小鼠購回后于動物房適應性飼養3?d，期間自由飲水進食。

小鼠適應性喂養結束后，隨機分成6組，即正常對照組、免疫應激模型組、地塞米松給藥組（5?mg·kg-1），以及L-茶氨酸低（100?mg·kg-1）、中（300?mg·kg-1）、高（500?mg·kg-1）劑量組，每組10只。L-茶氨酸和地塞米松用生理鹽水配制成相應濃度，空白對照組和模型組灌喂等量生理鹽水，各組小鼠于每日定時接受灌喂，灌喂量為每只0.3?mL，連續灌喂30?d。最后一次灌喂結束后禁食12?h，除空白對照組以外，其余各組小鼠腹腔注射大腸桿菌E44813（0.6×108cfu·mL-1）0.02?mL·g-1，5?h后摘眼球取血，并解剖取肝臟、脾臟。

1.2.2臟器指數測定

將肝臟、脾臟于4℃生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干表面水分后稱重。

計算方法：肝臟（脾臟）指數=肝臟（脾臟）質量/小鼠體質量×100%

1.2.3肝組織病理學觀察

剪取肝臟右葉同一部位經10%甲醛固定24?h，石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.2.4血清ALT、AST、IFN-γ、IL-4測定

各組小鼠摘眼球取血，在冰上靜置2?h，3?000?r·min-14℃離心10?min，取上清液，嚴格按試劑盒說明書步驟操作檢測血清ALT、AST水平。同時嚴格按ELISA試劑盒說明書檢測IFN-γ、IL-4表達量。

1.2.5肝組織勻漿MDA、SOD、GSH-Px、CAT的測定

取凍存組織，液氮研磨，加預冷生理鹽水制備10%的肝勻漿，嚴格按試劑盒說明書步驟操作檢測肝臟MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平。

1.3 數據統計

采用SPSS20.0統計軟件進行數據方差分析，各組間采用最小顯著差數法（LSD）檢驗，統計結果以均數±標準差（）表示，<0.05表明有顯著性差異，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠體征觀察結果

產腸毒性大腸桿菌E44813腹腔注射小鼠后，各組小鼠生理狀況表現出一定的差異，ETEC模型組小鼠表現為弓背、皮毛蓬松易脫落，呼吸緩慢，行動遲緩，精神萎靡，嗜睡，大便稀稠帶白色粘液及血跡；而L-茶氨酸各劑量組及地塞米松組小鼠亦出現上述癥狀及體征，但均有所減輕，且以300 mg·kg-1L-茶氨酸劑量組上述癥狀最輕。

2.2 L-茶氨酸對免疫應激模型小鼠肝臟、脾臟指數的影響

L-茶氨酸對試驗各組小鼠肝臟、脾臟指數的影響結果見表1。從表中可以看出，與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟、脾臟指數顯著升高（<0.01）；L-茶氨酸各劑量處理組和地塞米松組均能顯著降低大腸桿菌E44813引起的肝臟、脾臟指數升高（<0.05或<0.01）。

表1 L-茶氨酸對各組小鼠肝臟、脾臟指數的影響（n=10）

注：與正常組比較，##：<0.01；與模型組比較，*：<0.05，**：<0.01。下同。

Note: Compared with normal group, ##:<0.01. Compared with model group: *:<0.05, **:<0.01. The same below.

2.3 L-茶氨酸對免疫應激模型小鼠肝臟病理的影響

經HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織的病變情況，結果如圖1所示。正常組小鼠肝組織肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀，核膜清晰核仁明顯；模型組肝組織損傷嚴重，肝小葉結構破壞，小葉內有大量空泡狀病變，伴中性粒細胞單核細胞等炎癥細胞浸潤；地塞米松組和L-茶氨酸各劑量組僅有少量炎癥細胞浸潤及小空泡，說明其均能減輕大腸桿菌引起的肝臟組織病變范圍與程度。

注：a：正常組；b：模型組；c：茶氨酸低劑量組；d：茶氨酸中劑量組；e：茶氨酸高劑量組；f：地塞米松組。

2.4 L-茶氨酸對免疫應激模型小鼠血清ALT、AST的影響

ALT、AST是目前臨床上常用的肝細胞損傷生化指標，當肝臟發生損傷時血清中ALT、AST顯著升高。由表2可知，與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（<0.01），表明產腸毒性大腸桿菌感染嚴重損傷肝臟；茶氨酸各劑量組和地塞米松組均能明顯降低產腸毒性大腸桿菌E44813引起的小鼠血清ALT、AST的升高（<0.01），減輕肝損傷，其中以L-茶氨酸中劑量組效果最佳。

表2 L-茶氨酸對各組小鼠血清ALT、AST的影響（n=10）

2.5 L-茶氨酸對免疫應激模型小鼠血清IFN-γ、IL-4表達量的影響

由表3可以看出，與正常對照組比較，模型組小鼠血清促炎因子IFN-γ和抗炎因子IL-4表達顯著升高（<0.01），說明炎癥反應劇烈；L-茶氨酸各劑量組和地塞米松組均能顯著降低產腸毒性大腸桿菌E44813引起的小鼠血清IFN-γ、IL-4升高（<0.01），減輕炎癥反應，其中以L-茶氨酸中劑量組效果最佳。

表3 L-茶氨酸對各組小鼠血清IFN-γ、IL-4的影響（n=10）

2.6 L-茶氨酸對免疫應激模型小鼠肝組織勻漿MDA、SOD、GSH-Px、CAT的影響

MDA為脂質過氧化產物，間接反映細胞損傷程度。圖2顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織勻漿MDA顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低（<0.01）；與模型組相比，L-茶氨酸各劑量組和地塞米松組MDA顯著降低（<0.01），SOD、CAT活性顯著升高（<0.01）；與模型組比較，L-茶氨酸低、中劑量組GSH-Px顯著升高（<0.01），L-茶氨酸高劑量組和地塞米松組與模型組比較GSH-Px差異不顯著，無統計學意義。

3 討論

肝臟作為機體重要的免疫器官，含有豐富的kupffer細胞，正常情況下可以清除通過門靜脈進入肝臟的微生物、內毒素、異種抗原和免疫復合物等大分子物質，從而起到抵御細菌感染的作用[18]。當機體受到嚴重創傷、燒傷、感染時，腸黏膜通透性增高，導致細菌及細菌產物易位，由腸腔進入門靜脈血流，大量細菌感染造成肝臟kupffer細胞的過度激活，一方面釋放大量細胞因子、炎癥介質，產生炎癥級聯反應，誘導肝損傷；另一方面生成大量氧自由基，脂質過氧化物堆積，抗氧化酶活性降低，進一步使肝損傷加劇，造成肝臟功能衰退，一旦肝臟遭受損傷，機體整個免疫系統紊亂，細菌迅速傳播全身，進一步引發多器官衰竭，甚至死亡[19-20]。因此，提高肝臟免疫力，減輕肝損傷，防止細菌蔓延是防治大腸桿菌感染的關鍵。

本研究以產腸毒性大腸桿菌E44813腹腔注射小鼠，注射后各組小鼠生理狀況表現出一定的差異，模型組小鼠表現為弓背、皮毛蓬松易脫落，呼吸緩慢，行動遲緩，嗜睡，大便稀稠帶白色粘液及血跡，肝臟病理切片可見出血，肝小葉結構破壞，小葉內大量空泡狀病變，伴中性粒細胞單核細胞等炎癥細胞浸潤等病變，肝臟、脾臟指數顯著升高，小鼠血清ALT、AST、IFN-γ、IL-4及肝組織勻漿MDA顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低，說明產腸毒性大腸桿菌感染造成小鼠肝臟抗氧化能力下降，炎癥反應劇烈，嚴重損傷肝臟。L-茶氨酸低、中劑量組及地塞米松給藥組顯著降低了大腸桿菌誘導的ALT、AST、MDA、IFN-γ、IL-4的升高，升高SOD、CAT活性，其中以300 mg·kg-1劑量的L-茶氨酸效果最好，說明L-茶氨酸對免疫應激小鼠肝臟保護作用與減輕體內炎癥反應、增強肝臟抗氧化能力、減少自由基生成、減輕氧化應激損傷密切相關。

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Study on the Protective Effect of L-Theanine on the Liver of Mice with Immune Stress Induced by ETEC

LIU Qiuling1,2, GONG Zhihua1,2, CHENG Ling1,2, LIU Zunying1,2, DENG Yanli1,2, CHEN Dong1, XIAO Wenjun1,2,3*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

SPF grade Balb/c female mice were used for this experiment. After adaptive feeding for 3?d, the mice were pre-treated orally with different dosages of L-theanine once daily for 30?d. ETEC E44813 intraperitoneal injection was subsequently performed and samples were collected 5h later. The coefficient of liver and spleen, levels of serum alanine aminotranferease (ALT), aspartate aminotransferase (AST) as well as liver homogenate malondialdehyde (MDA), and activities of liver homogenate superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px), pathological changes of liver, expressions of serum γ-Interferon (IFN-γ) and Interleukin-4 (IL-4) were studied to explore the protective effects of L-theanine on liver of ETEC immune mouse model. Results show that pretreatment with L-theanine significantly reduced the increase of liver and spleen coefficient caused by ETEC infection, lowered the levels of serum ALT, AST and liver homogenate MDA, increased the activities ofliver homogenate SOD, CAT, GSH-Px, decreased the expressions of serum IFN-γ, IL-4, and improved pathological injury of liver tissue. Therefore, it can be concluded that L-theanine is able to prevent ETEC-induced hepatic injury through depressing IFN-γ, IL-4 and inflammatory reaction and enhancing hepatocyte antioxidant abilities.

L-theanine, enterotoxigenicE44813, immune stress, liver protection

Q51；Q939.1

A

1000-369X（2016）05-484-07

2016-01-20

2016-03-21

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAD10B00）

劉秋玲，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用研究。

xiaowenjun88@sina.com