高脂飼糧對生長育肥豬肉品質和骨骼肌蛋白質組的影響

熊　火，蔡　欣，劉靜波，*，陳　亮，張宏福

(1．西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

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高脂飼糧對生長育肥豬肉品質和骨骼肌蛋白質組的影響

熊火1，蔡欣1，劉靜波1，2*，陳亮2，張宏福2

(1．西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

本試驗旨在研究高脂飼糧對生長育肥豬肉品質和骨骼肌蛋白質組的影響。選擇20頭平均體重為(73.28±0.57) kg的生長育肥豬，隨機分為對照組(對照飼糧，含10.0%玉米淀粉)和試驗組(高脂飼糧，含10.0%豬油)，每個處理10個重復，每個重復1頭豬，試驗期42 d。研究飼糧脂肪含量對生長育肥豬生長性能、肉品質和骨骼肌蛋白質表達譜差異的影響。結果表明：高脂飼糧顯著提高了生長育肥豬的平均日增重(P<0.05)，并降低了料重比(P<0.01)。骨骼肌pH45 min、pH24 h、肌內脂肪含量、亮度、紅度、黃度、蒸煮損失、滴水損失和剪切力不受飼糧脂肪含量的影響(P>0.05)。蛋白質組學分析表明，飼喂高脂飼糧上調了生長育肥豬骨骼肌中鈣網蛋白、肌球蛋白重鏈、加帽蛋白、丙酮酸激酶、烯醇化酶、乳酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、腺苷酸激酶、載脂蛋白A和B、脂肪酸結合蛋白、熱休克蛋白27 ku和70 ku等蛋白質的表達量，但下調了肌球蛋白輕鏈和磷酸葡萄糖變位酶蛋白質的表達量。由此可見，采食高脂飼糧可顯著改善生長育肥豬的生長性能，并上調骨骼肌中與脂質代謝、葡萄糖和能量代謝等生物學功能相關的蛋白質表達量。

高脂飼糧；肉品質；蛋白質組學；豬

能量攝入不足是限制生長育肥豬后期生長性能的主要因素，因此，養豬生產常通過增加飼糧脂肪含量的營養途徑改善生長育肥豬的生長速度和飼料報酬[1]。與此同時，育肥豬脂質沉積和肉品質也在一定程度上受到飼糧脂肪含量和能量水平提高的影響[2]，但也有研究表明肌內脂肪含量不受飼糧脂肪和能量水平的影響[3-4]。此外，前期研究還發現飼糧添加共軛亞油酸可增加肌內脂肪沉積[5]，但也有研究發現共軛亞油酸對肌內脂肪沉積無顯著影響或降低肌內脂肪含量[6-7]。由此可見，前期關于飼糧添加脂肪對生長育肥豬背膘沉積和肌內脂肪沉積的研究結果并不一致。

將雙向電泳和質譜鑒定相結合的蛋白質組學技術可有效分析豬骨骼肌中數以千計的蛋白質表達量，該技術目前已被廣泛應用于研究生長模式、飼糧能量來源和脂肪酸組成對肉品質相關蛋白質表達量的影響[8]。因此，為探究飼糧脂肪含量與生長育肥豬骨骼肌能量代謝和脂質代謝等過程中相關蛋白質表達量之間的關系，本試驗通過蛋白質組學技術研究高脂飼糧對生長育肥豬肉品質和骨骼肌蛋白質組的影響，為探索營養途徑調控育肥豬骨骼肌能量代謝和脂質代謝奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗設計和飼養管理

試驗采用單因子試驗設計，選擇20頭體重(平均體重(73.28±0.57) kg)相似的杜長大三元雜交去勢公豬，隨機分到對照組(對照飼糧)和試驗組(高脂飼糧)，每個處理10個重復，每個重復1頭豬。對照組飼糧為含有10.0%玉米淀粉的玉米豆粕型飼糧，試驗組通過在對照組飼糧中添加10.0%的豬油替代玉米淀粉構成高脂飼糧，具體飼糧組成和營養水平見表1。試驗期間動物飼養于代謝籠內，室內溫度控制在18～22 ℃，自然光照，自由采食和飲水，試驗期42 d。在試驗開始和結束時記錄每頭豬的體重，用于計算平均日增重。記錄試驗期間每頭豬的飼料消耗總量，用于計算平均日采食量和料重比(平均日采食量/平均日增重)。

1.2樣本收集

試驗結束時，動物空腹8 h后麻醉放血處死，在胸椎與腰椎結合處收集背最長肌樣本用于測定肉品質，將蛋白質組學分析的樣品置于液氮中保存。

1.3胴體品質和肉品質測定指標與方法

1.3.1屠宰率屠宰率由胴體重(去除頭、蹄、尾和內臟組織后的重量)除以宰前活重計算得出。

1.3.2平均背膘厚分別測定左側胴體肩部最厚處、胸腰結合處和腰薦結合處3點的背膘厚度，取平均值作為平均背膘厚。

1.3.3剪切力將新鮮肌肉組織切片后置于水浴鍋中加熱使其中心溫度達到71 ℃，而后由剪切力測定儀(Texture Analyser，TA.XT.Plus.Stable Micro system)測定肌肉樣本的剪切力。1.3.4肌內脂肪將5 g左右肌肉樣本冷凍干燥后采用索氏抽提法提取油脂后用于計算肌內脂肪含量。1.3.5肉色采用CR-400(MINOLTA)色差計對肌肉樣本進行肉色評分。

1.3.6pH試驗動物屠宰45 min和24 h后使用pH-STAR(SFK-Techbology，Denmark)測定肌肉樣本pH。

1.3.7滴水損失將新鮮肌肉組織剪成長5 cm、寬2 cm、厚3 cm的肉柱后稱重，用鐵絲掛住樣本保持肌纖維垂直向下后置于氣體充盈的塑料薄膜口袋，扎緊袋口懸掛于4 ℃冰箱內貯藏24 h后稱重，計算滴水損失。

1.3.8蒸煮損失將肌肉樣本剪成長4 cm、寬4 cm、厚2.5 cm肉塊后置于蒸煮袋內排盡空氣后密封，在75 ℃水浴鍋中加熱30 min后取出樣本冷卻至室溫稱重，計算蒸煮損失。

表1飼糧組成和營養水平(風干基礎)

Table 1Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

%

預混料為每千克日糧提供：Cu(CuSO4·5H2O) 10 mg，Fe(FeSO4·7H2O)80 mg，Mn(MnSO4·H2O)20 mg，Zn(ZnSO4·H2O)80 mg，Se(Na2SeO3)0.5 mg，I(KI)0.5 mg，VA 8 000 IU，VD32 000 IU，VE 12 IU，VK31.2 mg，VB11.5 mg，VB24 mg，VB62 mg，VB120.02 mg，生物素0.08 mg，泛酸12 mg，煙酸20 mg

Premix provided per kilogram of diet：Cu(CuSO4·5H2O) 10 mg，Fe(FeSO4·7H2O)80 mg，Mn(MnSO4·H2O)20 mg，Zn(ZnSO4·H2O)80 mg，Se(Na2SeO3)0.5 mg，I(KI)0.5 mg，VA 8 000 IU，VD32 000 IU，VE 12 IU，VK31.2 mg，VB11.5 mg，VB24 mg，VB62 mg，VB120.02 mg，biotin 0.08 mg，pantothenic acid 12 mg，niacin 20 mg

1.4骨骼肌蛋白質組學分析1.4.1蛋白質提取和熒光標記取少量骨骼肌(約0.2 g)樣本于研缽中加入液氮以及含蛋白酶抑制劑的緩沖液(7 mol·L-1脲，2 mol·L-1硫脲，4% 3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，50 mmol·L-1二硫蘇糖醇，1%蛋白酶抑制劑)，粉碎組織破碎細胞后離心取上清液于-80 ℃保存。Bradford法測定蛋白濃度后在各樣本中取200 μg蛋白質在組內隨機混合為5個樣本(每兩份樣本混合成一份)用于蛋白質組學分析。按照DIGE試劑盒(GE Healthcare)說明進行熒光標記[9]。

1.4.2雙向電泳及圖象掃描分析第一向等電聚焦程序：1)線性升壓至250 V，持續時間 30 min；2)快速升壓至1 000 V，持續時間1 h；3)線性升壓至10 000 V，持續時間5 h；4)快速升壓至10 000 V，持續時間 60 000 Vh。二維電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳在Ettan DALT(GE Healthcare)上進行，具體電泳過程如J.Liu等[9]所描述。電泳結束后使用Typhoon 9410TM熒光掃描儀(GE Healthcare)進行凝膠掃描，不同染料激發/發射波長分別為Cy2 (488/520 nm)、Cy3(532/580 nm)和Cy5(633/670 nm)。使用DeCyderTMv 6.5(GE Healthcare)軟件對掃描圖像進行比對分析，對掃描后凝膠上蛋白點進行膠內分析，然后再將不同膠上的同一蛋白點與內參匹配進行膠間分析，最終根據每個蛋白點匹配后的相對表達量確定差異表達蛋白。飼糧處理間蛋白質表達量差異比絕對值大于1.2，P<0.05的蛋白選定為目的蛋白，用于質譜分析。

1.4.3目的蛋白的定性使用制備膠分離目的蛋白，電泳過程如臧長江等[10]所描述，染色方法為考馬斯亮藍染色，蛋白質上樣量為1 000 μg。凍干后的膠粒加入胰蛋白酶溶液，使用5%三氟乙酸溶解37 ℃條件下水解產生的肽混合物后，用0.5 μL肽溶液與1 μL基質(4-羥基-α-氰基肉桂酸，50%乙脲，0.1%三氟乙酸)相混合。使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜或串聯質譜技術檢測分析肽混合液(4800 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)，獲取肽的指紋圖譜。選擇MASCOT 搜索軟件與其他哺乳動物數據庫(NCBI)蛋白質進行匹配，根據蛋白評分確定目的蛋白種類。分析過程使用GPS ExplorerTM軟件(3.6版本，Applied Biosystems)，軟件評分>67代表P<0.05。

1.5統計分析

采用SAS統計軟件中的One-way ANOVA程序分析試驗數據，結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05認為差異顯著。

2　結　果

從表2結果可以看出，生長育肥豬采食高脂飼糧導致平均日增重(ADG)、試驗結束時的活體重和胴體重顯著增加(P<0.05)，并極顯著降低了料重比(P<0.01)。平均日采食量(ADFI)、屠宰率和平均背膘厚不受飼糧脂肪含量的影響(P>0.05)。從表3可知，生長育肥豬背最長肌的pH45 min、pH24 h、肌內脂肪含量、亮度、紅度、黃度、蒸煮損失、滴水損失和剪切力等肉品質相關指標均不受飼糧脂肪含量因素的影響(P>0.05)。

通過使用雙向差異凝膠電泳技術，本試驗共分離出約2 000個蛋白點(圖1)，其中16個蛋白質的表達量受飼糧脂肪含量的影響，這些蛋白質的功能主要涉及到：(1)細胞凋亡；(2)細胞結構；(3)葡萄糖和能量代謝；(4)脂質代謝；(5)應激反應。由表4可以看出，采食高脂飼糧上調了生長育肥豬骨骼肌中鈣網蛋白、肌球蛋白重鏈、加帽蛋白、丙酮酸激酶、烯醇化酶、乳酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、腺苷酸激酶、載脂蛋白A和B、脂肪酸結合蛋白、熱休克蛋白27 ku和70 ku等蛋白質的表達量，但下調了肌球蛋白輕鏈和磷酸葡萄糖變位酶的蛋白質表達量。

表2高脂飼糧對生長育肥豬生長性能和胴體品質的影響

Table 2Effect of high-fat diet on growth performance and carcass traits of growing-finishing pigs

項目Item對照飼糧Controldiet高脂飼糧High-fatdietP值P-value初始體重/kgInitialBW73.36±0.6173.19±0.530.837平均日采食量/(kg·d-1)Averagedailyfeedintake3.01±0.092.86±0.070.287平均日增重/(kg·d-1)Averagedailygain0.93±0.031.06±0.04<0.05料重比Feed/gain3.24±0.112.69±0.14<0.01活體重/kgLiveweight112.63±1.98117.7±1.34<0.05胴體重/kgCarcassweight73.92±1.3078.56±1.10<0.05屠宰率/%Dressingrate65.72±1.0466.74±0.950.506平均背膘厚/cmMeanbackfatthickness2.19±0.102.33±0.080.434

3　討　論

飼糧能量水平是影響育肥豬生長性能的重要因素，本試驗結果表明，飼糧添加10.0%的豬油可顯著提高生長育肥豬后期生長速度并改善飼料報酬，但對胴體品質和肉品質無顯著影響，這與前期研究結果基本一致[1，4，11]。蛋白質組學分析結果表明，飼喂高脂飼糧顯著影響育肥豬骨骼肌中涉及葡萄糖和能量代謝、脂質代謝以及應激反應的相關蛋白表達量。因此，本研究圍繞高脂飼糧對具有不同生物學功能蛋白表達量的調控，從分子水平上檢測其對生長育肥豬骨骼肌脂質代謝、葡萄糖和能量代謝的影響。

表3高脂飼糧對生長育肥豬肉品質的影響

Table 3Effect of high-fat diet on meat quality traits of growing-finishing pigs

項目Item對照飼糧Controldiet高脂飼糧High-fatdietP值P-valuepH45min6.65±0.076.55±0.080.405pH24h5.60±0.055.54±0.040.374肌內脂肪含量/%Intramuscularfatcontent3.86±0.153.98±0.170.570亮度Lightness45.27±1.7144.67±1.890.815紅度Redness6.64±0.787.33±0.860.556黃度Yellowness3.14±0.183.49±0.210.245蒸煮損失/%Cookingloss35.27±1.4033.43±1.520.365滴水損失/%Driploss3.79±0.153.67±0.180.642剪切力/kgShearforce4.97±0.194.79±0.220.545

圖1　生長育肥豬骨骼肌熒光差異雙向電泳圖譜Fig.1　Two-dimensional different in-gel electrophoresis image of the skeletal muscle proteome map of growing-finishing pigs

表4高脂飼糧對生長育肥豬骨骼肌蛋白質組的影響

Table 4Effect of high-fat diet on skeletal muscle proteome of growing-finishing pigs

蛋白點Spot蛋白名稱Poteinname登錄號AccessionNo.評分Score分子量/uMolecularweight等電點Isoelectricpoint表達水平Expressionlevel細胞凋亡Cellularapoptosis1鈣網蛋白Calreticulingi|23742018846616.94.33+1.33細胞結構Cellstructure2肌球蛋白重鏈Myosinheavychaingi|178056718152223097.35.60+1.353加帽蛋白Cappingproteingi|43330813632726.55.58+1.394肌球蛋白重鏈Myosinheavychaingi|157954424180222928.25.62+1.425肌球蛋白輕鏈Myosinlightchaingi|583468413916719.24.63-1.38葡萄糖和能量代謝Glucoseandenergymetabolism6丙酮酸激酶Pyruvatekinasegi|1675799435857780.96.63+1.547磷酸葡萄糖變位酶1Phosphoglucomutase1gi|374694419015077.74.88-1.568烯醇化酶3Enolase3gi|15326742718746902.37.59+1.489乳酸脫氫酶-ALactatedehydrogenase-Agi|21759021035560.78.17+1.9510磷酸丙糖異構酶Triosephosphateisomerasegi|53842619426903.86.45+1.4511腺苷酸激酶1Adenylatekinase1gi|450201120721621.38.73+1.53脂質代謝Lipidmetabolism12載脂蛋白BApolipoproteinBgi|19709885416025718.94.77+1.6713載脂蛋白AApolipoproteinAgi|16435918230311.75.38+1.5814脂肪酸結合蛋白Fattyacid-bindingproteingi|22799414714716.77.00+2.12應激反應Stressresponse15熱休克蛋白70kuHeatshockprotein70kugi|1650723724072288.45.07+1.5316熱休克蛋白27kuHeatshockprotein27kugi|5091634216014211.25.94+1.78

骨骼肌蛋白質總量的80%由肌球蛋白、肌動蛋白、肌聯蛋白和伴肌動蛋白組成，其中肌球蛋白占肌纖維蛋白的45%。肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈作為肌球蛋白的主要組成部分，對肌纖維結構和肉的嫩度具有顯著影響。R.Lametsch等[12]研究表明，肌肉剪切力與動物屠宰后肌球蛋白降解片段肌球蛋白重鏈顯著負相關，與肌球蛋白輕鏈的降解顯著正相關。在本試驗條件下，高脂飼糧在不影響育肥豬骨骼肌剪切力的情況下，分別上調和下調了肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈的表達量，這與R.Lametsch等[12]的研究結果相比存在一定的差異，導致上述差異的原因可能在于不同試驗的剪切力測定時間有所不同，從而影響了肌肉的嫩化。加帽蛋白表達量與肌肉剪切力之間的相關性在前期研究中已有所報道[13]，雖然在本試驗中高脂飼糧上調了加帽蛋白的表達量，但肌肉剪切力未受飼糧脂肪含量的影響，表明上述蛋白質的表達量對肌肉嫩度影響較小。鈣網蛋白作為分子伴侶參與蛋白的折疊和轉運，從而影響肌肉收縮等生物學功能[14]，飼糧脂肪含量對其表達量的影響表明骨骼肌收縮等基本功能可能受高脂飼糧的影響。

脂肪酸結合蛋白作為脂肪酸的轉運載體，其表達量與肌內脂肪細胞數量和脂肪含量顯著正相關，肌內脂肪含量較高品種豬的脂肪酸結合蛋白表達量顯著高于肌內脂肪含量較低的豬種[15-16]。運載脂質和穩定脂蛋白結構是載脂蛋白的主要生物學功能，肝是其主要合成部位。載脂蛋白作為高密度脂蛋白的重要組成部分，負責將脂類物質轉運至靶器官[17]。與前期D.H.Kim等[18]的研究一致，本試驗結果表明，高脂飼糧顯著上調骨骼肌中與脂質代謝相關的脂肪酸結合蛋白和載脂蛋白表達量，但背膘沉積和肌內脂肪含量不受飼糧脂肪含量的影響。對照組飼糧能量水平可能已滿足生長育肥豬最大肌內脂肪沉積的能量需要量，從而導致肌內脂肪含量不受高脂飼糧的影響，這與陳德志等[3]和蔡傳江等[4]的研究結果基本一致。

流行病學研究已經證實，高脂飼糧誘導的能量代謝異常是導致發胖的主要原因。丙酮酸激酶作為糖酵解過程的三大限速酶之一，催化葡萄糖分解產生乙酰輔酶A用于氧化供能[19]。腺苷酸激酶催化ATP使AMP磷酸化形成兩分子的ADP[20]；烯醇化酶作為糖酵解的關鍵酶之一，催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸[21]；磷酸丙糖異構酶催化磷酸二羥丙酮轉化為3-磷酸甘油醛從而進入糖酵解途徑[22]。采食高脂飼糧顯著上調上述4種蛋白質的表達量，表明動物機體需要提高能量消耗從而適應攝入的過多能量，這與D.H.Kim等[18]的研究結果一致。此外，參與能量代謝的磷酸葡萄糖變位酶在采食高脂飼糧的生長育肥豬骨骼肌中表達量卻顯著下降，與D.H.Kim等[18]的研究結果存在一定差異。乳酸脫氫酶活力是調控動物屠宰后乳酸生成的主要因素，乳酸脫氫酶活力較高意味著較高的乳酸生成率以及宰后pH下降加快[23]。雖然本試驗條件下不同處理組之間骨骼肌的pH45 min和pH24 h無顯著差異，但高脂飼糧對乳酸脫氫酶表達量的調控表明飼糧脂肪含量可能對動物屠宰后肌肉的pH變化有所影響。

熱休克蛋白(HSP)具有維持細胞穩恒、損傷修復、穩定未折疊蛋白、避免蛋白聚集以及重塑變性蛋白等功能[24]。作為分子伴侶，HSP的表達量在應激條件下顯著上調。在本試驗中，高脂飼糧顯著上調了育肥豬骨骼肌中HSP 27 ku和HSP 70 ku的蛋白表達量，表明飼糧脂肪攝入過多對動物造成一定程度的氧化應激，從而需要較高的HSP表達量以維持機體能量代謝和氧化還原反應的平衡，這與D.C.Henstridge等[25]的研究結果一致。

4　結　論

4.1飼喂高脂飼糧可改善生長育肥豬生長性能，但對肉品質無顯著影響。

4.2飼喂高脂飼糧顯著改變生長育肥豬骨骼肌中與脂質代謝、葡萄糖和能量代謝以及應激反應等生物學功能相關蛋白質的表達量。

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(編輯郭云雁)

Effects of High-fat Diet on Meat Quality Traits and Skeletal Muscle Proteome of Growing-finishing Pigs

XIONG Huo1，CAI Xin1，LIU Jing-bo1，2*，CHEN Liang2，ZHANG Hong-fu2

(1.SchoolofLifeScienceandEngineering，SouthwestUniversityofScienceandTechnology，Mianyang621010，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The present study was conducted to investigate the effect of high-fat (HF) diet on meat quality traits and skeletal muscle proteome of growing-finishing pigs.Twenty growing-finishing pigs with an average initial BW of (73.28±0.57) kg were randomly allocated to control group (control diet，supplemented with 10.0% cornstarch) and treatment group (high-fat diet，supplemented with 10.0% lard) to study the effect of dietary fat content on growth performance，meat quality traits and skeletal muscle proteome of growing-finishing pigs.There were 10 replicates in each treatment group with 1 pig per replicate.The experiment lasted 42 d.The results showed that pigs fed the HF diet had a greater average daily gain (P<0.05)，but a lower ratio of feed to gain than pigs fed the control diet (P<0.01).The pH45 min，pH24 h，intramuscular fat content，lightness，redness，yellowness，cooking loss，drip loss and shear force in skeletal muscle of pigs were not affected by dietary fat content (P>0.05).Proteomic analysis revealed that pigs fed the HF diet had greater expression levels of calreticulin，myosin heavy chain，capping protein，pyruvate kinase，enolase，L-lactate dehydrogenase，triosephosphate isomerase，adenylate kinase，apolipoprotein A and B，fatty acid binding protein and heat shock protein 27 and 70 ku，but lower expression levels of myosin light chain and phosphoglucomutase than pigs fed the control diet.In conclusion，the HF feeding could improve the growth performance，and upregulate the expression levels of proteins related to lipid metabolism，glucose and energy metabolism in skeletal muscle of growing-finishing pigs.

high-fat diet；meat quality；proteome；pigs

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.014

2015-10-08

動物營養學國家重點實驗室開放課題(2004DA125184F1424)；國家科技支撐計劃項目(2012BDA39B01)；中國農業科學院科技創新工程(ASTIP-IAS07)

熊火(1970-)，男，四川綿陽人，講師，主要從事單胃動物生理和營養研究，E-mail：xiongjiumu@163.com

劉靜波，講師，博士，主要從事抗病營養和單胃動物磷營養研究，E-mail：liuswust@163.com

S828；S816.71

A

0366-6964(2016)10-2052-08