兒童神經母細胞瘤Klf4表達及其影響因素研究

朱秀麗，曲 凡，李美楠，鄭 鈺，陳 健，張文婷

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·論著·

兒童神經母細胞瘤Klf4表達及其影響因素研究

朱秀麗，曲 凡，李美楠，鄭 鈺，陳 健，張文婷

目的探討兒童神經母細胞瘤(NB)Klf4表達情況及其影響因素。方法選取2007年1月—2013年3月于河北醫科大學第四醫院兒科治療的NB患兒33例為病例組，另選取同期本院嚴重腎盂積水患兒10例為對照組。記錄兩組患兒臨床資料，取病例組病理組織，對照組殘余的正常腎上腺組織，采用免疫組化SP法檢測Klf4表達情況，根據染色強度和Klf4陽性細胞所占百分比評價Klf4表達強度。結果病例組Klf4表達陽性10例(30.3%)，對照組Klf4表達陽性9例(9/10)，病例組Klf4表達陽性率低于對照組(χ2=8.801，P=0.003)。病例組不同性別、年齡、病理分期患兒Klf4表達陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。病例組節細胞-神經母細胞瘤患兒Klf4表達陽性率高于神經母細胞瘤患兒，術前化療患兒Klf4表達陽性率高于術前未化療患兒(P<0.05)。結論NB患兒Klf4表達下降，且與NB分型有關，術前化療藥物可能對Klf4的表達產生影響。

神經母細胞瘤；Klf4；兒童

朱秀麗，曲凡，李美楠，等.兒童神經母細胞瘤Klf4表達及其影響因素研究[J].中國全科醫學，2016，19(30)：3694-3697.[www.chinagp.net]

ZHU X L,QU F，LI M N,et al.Expression and influence factors of Klf4 among children with neuroblastoma[J].Chinese General Practice，2016，19(30)：3694-3697.

神經母細胞瘤(NB)是兒童最常見的顱外實體腫瘤，占兒童腫瘤的7%～10%[1]。NB惡性程度高，易早期轉移，多數患兒就診時已達中晚期。化療是NB的主要治療手段，治療過程中易出現化療耐藥和復發，治療效果差，預后不良。目前，隨著對腫瘤的不斷深入研究，有學者提出腫瘤干細胞(TSCs)的概念，并認為TSCs在惡性腫瘤發生、發展、轉移、化療耐藥及復發中發揮重要作用，其特性決定腫瘤治療的敏感性和結局[2]。Klf4為胚胎性干細胞轉錄調控基因，是調控胚胎發育的關鍵因子，在胚胎早期發育過程中對維持胚胎干細胞多潛能性和自我更新能力具有關鍵性的調控作用，并且對于維持TSCs的特性也發揮重要作用[3]。目前，Klf4在NB中作用的研究報道較少。本研究旨在通過觀察干細胞轉錄因子Klf4在NB中的表達，分析其與患兒臨床病程、病理類型的關系，探索其在NB發生、發展中發揮的作用，為臨床NB的診治提供參考。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2007年1月—2013年3月于河北醫科大學第四醫院兒科治療的NB患兒33例為病例組，其中男21例，女12例；年齡1～9歲，中位年齡5(3)歲。納入標準：(1)根據組織學及免疫表型特點，經手術切除或活檢病理檢查證實為NB；(2)年齡<14歲；(3)臨床資料完整，病理標本能夠滿足本研究需要。

1.2方法

1.2.1資料收集記錄兩組患兒性別、年齡、疾病分型、病理分期及術前是否化療。

1.2.2Klf4表達檢測Klf4兔抗人多克隆抗體購自Prosci Incorporated公司，按1∶100稀釋；免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。取病例組病理組織標本，對照組殘余的正常腎上腺組織標本。標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，依次經固定、脫水、熱抗原修復、過氧化酶活性阻斷、封閉抗原、一抗及二抗孵育、顯色、復染、封固處理，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，選擇實驗獲得陽性標本作為陽性對照。Klf4染色陽性部位位于NB細胞質，根據染色強度分為:0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。根據Klf4陽性細胞所占百分比分為0分(陰性)、l分(陽性細胞所占百分比≤10%)、2分(陽性細胞所占百分比為11%～50%)、3分(陽性細胞所占百分比為51%～75%)、4分(陽性細胞所占百分比≥76%)。以兩者評分乘積將Klf4表達強度分為4個等級：陰性(0～2分)、弱陽性(3～4分)、中度陽性(5～8分)、強陽性(9～12分)[1]。

1.3統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，非正態分布的計量資料以M(QR)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組Klf4表達陽性率比較病例組Klf4表達陽性10例(30.3%)，對照組Klf4表達陽性9例(9/10)，病例組Klf4表達陽性率低于對照組，差異有統計學意義(χ2=8.801，P=0.003，見圖1，本文彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net相應文章附件)。

2.2病例組不同臨床特征患兒Klf4表達陽性率比較病例組不同性別、年齡、病理分期患兒Klf4表達陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。病例組節細胞-神經母細胞瘤患兒Klf4表達陽性率高于NB患兒，術前化療患兒Klf4表達陽性率高于術前未化療患兒，差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

注：A示Klf4在病例組神經母細胞瘤中呈中度陽性表達，B示Klf4在病例組神經母細胞瘤中呈弱陽性表達，C示Klf4在病例組神經母細胞瘤中呈陰性表達，D示Klf4在對照組中呈中度陽性表達

圖1兩組Klf4的表達(SP染色，×200)

Figure 1Expression of Klf4 in two groups

表1病例組不同臨床特征患兒Klf4表達陽性率比較〔n(%)，N=33〕

Table 1Comparison of the positive rate of Klf4 expression among different clinical features in case group

臨床特征例數陽性陰性P值性別0.433 男215(23.8)16(76.2) 女125(41.7)7(58.3)年齡(歲)1.000 ≤5185(27.8)13(72.2) >5155(33.3)10(66.7)疾病分型0.010 節細胞-神經母細胞瘤96(6/9)3(3/9) NB244(16.7)20(83.3)病理分期0.444 Ⅲ期104(4/10)6(6/10) Ⅳ期236(26.1)17(73.9)術前化療<0.001 是139(69.2)4(30.8) 否201(5.0)19(95.0)

注：NB=神經母細胞瘤

3　討論

Klf4是Kruppel樣轉錄因子家族成員之一，因其常表達于胃腸道上皮細胞，故又稱胃腸富集Kruppel樣因子。Kruppel樣轉錄因子家族成員的共同特點是具有多個串聯型的C2H2(Cys2-His2)鋅指樣結構，能夠識別并特異性結合在富含GC的序列上。人類Klf4基因位于染色體9q31，長5 631 bp，有5個外顯子，編碼513個氨基酸殘基組成的蛋白，相對分子質量為54 671。Klf4在人體內多種組織和細胞中廣泛表達，參與多種生理功能，如胚胎發育、細胞增殖、分化、凋亡、維持干細胞的全能性等[4-7]。作為抑癌基因或癌基因，Klf4在腫瘤的發生、發展及轉移過程中發揮完全不同的作用。如Klf4可維持乳腺癌腫瘤干細胞的自我更新，促進癌細胞的侵襲和轉移，發揮癌基因作用[8]。而在非霍奇金及經典霍奇金淋巴瘤中則發揮抑癌基因的作用，GUAN等[9]研究顯示，在伯基特淋巴瘤細胞系中，Klf4可阻滯腫瘤細胞的細胞周期處于G0/G1期，從而抑制腫瘤細胞的增殖，并且誘導其凋亡。

本研究顯示，病例組Klf4表達陽性率低于對照組，提示Klf4在NB發生過程中可能發揮抑癌基因作用。研究發現，Klf4在同種腫瘤中可發揮癌基因和抑癌基因兩種完全相反的作用：如WEI等[10]研究認為，Klf4在胰腺癌中發揮癌基因的作用，并且Klf4表達上調能夠導致胰腺癌患者的生存時間縮短；而ZAMMARCHI等[11]研究顯示，在胰腺導管細胞癌中，基因組的缺失導致了Klf4的表達缺失，Klf4基因修復可抑制癌細胞的增殖，說明Klf4在胰腺癌發生過程中發揮抑癌基因的作用。在針對前列腺癌的研究中發現，前列腺癌、前列腺上皮內瘤變組織及前列腺正常組織Klf4表達水平依次降低，提示Klf4可能發揮了癌基因的作用[12]。而WANG等[3]研究則顯示，在前列腺癌細胞株Dupro和PC-3中，Klf4發揮抑癌基因作用，恢復Klf4的表達，可使細胞周期停滯于G2/M期，并且伴有cyclinB基因表達下調，提示Klf4基因可通過調節細胞周期蛋白使細胞周期停滯于G2/M期，抑制腫瘤細胞增殖。SHUM等[13]研究證實，但Klf4在NB中也發揮著抑癌基因的作用。但Klf4既可以作為癌基因，又可以作為抑癌基因的具體機制尚不明確。

本研究發現，病例組節細胞-神經母細胞瘤患兒Klf4表達陽性率高于NB患兒，提示Klf4表達水平與疾病分型相關。SHUM等[13]研究發現，Klf4過表達可使NB細胞失去神經母細胞的表型，而出現非致瘤性的平滑肌細胞的標志。FEINBERG等[14]在白血病細胞HL-60中也發現，敲除Klf4可抑制佛波酯所誘導的單核細胞分化，而Klf4過表達可使HL-60表現出成熟的單核細胞特征，因此筆者認為Klf4是單核細胞分化調控網絡中重要的調節因子。Klf4低表達與腫瘤的惡性程度有關，可能成為判斷預后的指標。在未來的研究中，可通過嘗試上調Klf4表達，誘導NB向分化良好的類型轉化，降低NB的惡性程度，改善患者預后。

本研究發現，病例組術前化療患兒Klf4表達陽性率高于術前未化療患兒，提示化療藥物的使用可上調Klf4的表達。MOHAN等[15]研究顯示，Klf4在惡性NB細胞系中發揮腫瘤抑制因子作用，可通過下調抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的表達，增強芹黃素對于惡性NB的抗癌作用。因此，上調Klf4表達的化療藥物在NB治療中可能獲得更好的療效。本研究未發現不同性別、年齡、病理分期的NB患兒Klf4表達陽性率間存在差異。

綜上所述，NB患兒Klf4表達下降，且與NB分型有關，術前化療藥物可能對Klf4的表達產生影響。本研究納入的NB患兒均為中晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，未能與NB早期(Ⅰ～Ⅱ期)患兒的Klf4表達陽性率比較，故結果尚存在一定的局限性。

作者貢獻：朱秀麗進行課題設計與實施、資料收集整理、成文并對文章負責；李美楠進行課題設計與實施、評估、資料收集整理；鄭鈺、陳健、張文婷協助收集資料；曲凡進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Expression and Influence Factors of Klf4 among Children with Neuroblastoma

ZHUXiu-li,QUFan，LIMei-nan,ZHENGYu,CHENJian,ZHANGWen-ting.

DepartmentofPediatrics,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Correspondingauthor:QUFan，DepartmentofPediatrics,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China；E-mail：13831128697@163.com

ObjectiveTo explore the expression and influence factors of Klf4 among children with neuroblastoma(NB).Methods33 children with NB who were treated in Department of Pediatrics of the Fourth Hospital of Hebei Medical University from January 2007 to March 2013,were selected as the case group,and 10 children with serious hydronephrosis in this hospital during the same period,were selected as the control group.The clinical data of two groups of children were recorded,the pathological tissues of the case group and the residual normal adrenal tissues of the control group were used as study subjects,the method of immunohistochemical SP was used to detect Klf4 expression.The expression intensity of Klf4 was evaluated according to the staining intensity and the percentage of Klf4 positive cells.Results10 cases(30.3%) in the case group had positive expression of Klf4,and 9 cases(9/10) in the control group had positive expression of Klf4,and the positive rate of Klf4 expression in the case group was significantly lower than that in the control group(χ2=8.801，P=0.003).In the case group,there was no significant difference in the positive rate of Klf4 expression among children with different sex,age and pathological stages(P>0.05).In the case group,the positive rate of Klf4 expression among children with ganglioneuroblastoma was significantly higher than that among children with neuroblastoma,and the positive rate of Klf4 expression among children who underwent preoperative chemotherapy was significantly higher than that among children who did not underwent preoperative chemotherapy(P<0.05).ConclusionThe level of Klf4 expression among children with NB is low,and level of Klf4 expression is related to NB classification.Preoperative chemotherapy drugs may influence the expression of Klf4.

Neuroblastoma；Klf4；Child

050011河北省石家莊市，河北醫科大學第四醫院兒科(朱秀麗，曲凡，鄭鈺，陳健，張文婷)；承德醫學院附屬醫院兒科(李美楠)

曲凡，050011河北省石家莊市，河北醫科大學第四醫院兒科；E-mail：13831128697@163.com

R 730.264

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.30.011

2016-03-20；

2016-07-18)