MUTYH基因多態性對原發性男性不育癥和精子DNA完整性的影響研究

申 琴，馬 強，劉春蓮，焦海燕

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·論著·

MUTYH基因多態性對原發性男性不育癥和精子DNA完整性的影響研究

申 琴，馬 強，劉春蓮，焦海燕

目的探討MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點單核苷酸多態性(SNPs)對原發性男性不育癥和精子DNA完整性的影響及其與吸煙、飲酒的交互作用。 方法選取2011年8月—2012年12月在寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心門診就診的245例原發性男性不育癥患者為病例組，其中少精弱精癥患者166例(少精弱精癥亞組)、精液指標正常男性不育癥患者79例(精液指標正常亞組)；另選取同期在寧夏醫科大學總醫院體檢健康且有生育史的男性329例為對照組。采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術分析MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點基因型分布和等位基因頻率。采用精子染色質擴散(SCD)試驗檢測精子DNA損傷程度，采用精子DNA斷裂指數(DFI)表示。結果對照組與病例組MUTYH基因rs3219489位點GG、CG、CC基因型分布比較,差異無統計學意義(P>0.05)； CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。對照組與病例組MUTYH基因rs10527342位點AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。對照組、少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組MUTYH基因rs3219489位點GG、CG、CC基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)；CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。3組MUTYH基因rs10527342位點AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。病例組精子DFI〔(46.2±22.3)%〕高于對照組〔(21.4±9.2)%〕(P<0.05)。少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組精子 DFI高于對照組，少精弱精癥亞組精子DFI高于精液指標正常亞組(P<0.05)。MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點不同基因型原發性男性不育癥患者精子 DFI 比較,差異無統計學意義(P>0.05)。MUTYH基因rs3219489位點與rs10527342位點間存在中度連鎖不平衡(D′=0.749，r2=0.289)。MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點與吸煙、飲酒均不存在交互作用(P>0.05)。 結論MUTYH基因rs3219489位點的C等位基因可能是原發性男性不育癥的保護因素，rs10527342位點可能與原發性男性不育癥無關。精子DFI的增加可能會導致原發性男性不育癥的患病風險增加。rs3219489、rs10527342位點可能對精子DNA完整性沒有影響，且與吸煙、飲酒均無交互作用。

不育,男(雄)性；MUTYH基因；多態性,單核苷酸；精子；DNA

申琴，馬強，劉春蓮，等.MUTYH基因多態性對原發性男性不育癥和精子DNA完整性的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(30)：3698-3704.[www.chinagp.net]

SHEN Q，MA Q，LIU C L，et al.Effect of MUTYH gene polymorphisms on primary male infertility and sperm DNA integrity[J].Chinese General Practice，2016，19(30)：3698-3704.

引起男性不育的病因復雜，如精子發生障礙、環境因素等，其中有70%以上的男性不育原因不明，臨床上稱為原發性男性不育癥(包括原發性無精子癥及少弱畸精子癥)。在很大程度上，原發性男性不育癥是由于精子發生過程中，相關基因的突變導致異常的生精過程所引起的不育[1]。精子發生(spermatogenesis)是一個高度復雜的細胞增生與分化過程，涉及睪丸內大量活性氧(ROS)的損害以及吸煙、飲酒等環境因素的影響，從而導致DNA損傷[2]。RYBAR等[3]指出，在原發性男性不育癥患者中，精子DNA損傷率較正常人明顯升高，說明精子DNA損傷與原發性男性不育癥密切相關。堿基切除修復MUTYH基因是DNA損傷修復中的主要途徑[4]。MUTYH基因功能的異常會導致低效的DNA修復和8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)的積累，造成DNA損傷[5]。MUTYH基因rs10527342位點(AluYb8MUTYH)和rs3219489位點(Gln324His)單核苷酸多態性(SNPs)是錯義突變位點，可能影響MUTYH基因的功能，從而導致個體DNA修復能力異常。因此，本研究探討MUTYH 基因多態性與原發性男性不育癥和精子DNA完整性的關系及其與吸煙、飲酒的交互作用，現報道如下。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2011年8月—2012年12月在寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心門診就診的245例原發性男性不育癥患者為病例組，其中少精弱精癥患者166例(少精弱精癥亞組)、精液指標正常男性不育癥患者79例(精液指標正常亞組)；年齡21～43歲，平均年齡(32.5±5.9)歲；符合《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》的診斷標準[6]，排除染色體異常者、Y染色體微缺失者、梗阻性無精子癥和激素異常者。另選取同期在寧夏醫科大學總醫院體檢健康且有生育史的男性329例為對照組，年齡28～71歲，平均年齡(51.0±15.5)歲。

1.2吸煙與飲酒情況收集受試者吸煙與飲酒情況，其中吸煙定義為每天吸煙不少于1支，持續1年，或總量不少于18包/年。飲酒定義為每周飲酒不少于2次；白酒不少于50 g/次，或其他酒類不少于500 ml/次。達不到此標準認定為不吸煙和不飲酒。

1.3標本采集使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的靜脈采血管抽取外周靜脈血3 ml，-20 ℃保存，用于基因組DNA提取；病例組患者提供1份精液標本(手淫法采集精液，收集患者一次排精量的精液)，-80 ℃保存，用于精子染色質擴散(SCD)試驗。另外收集67例對照組男性的精液標本作為SCD試驗的對照。本研究通過了寧夏醫科大學醫學倫理委員會批準并獲得所有受試者的知情同意。

1.4MUTYH基因SNPs分型

1.4.1DNA提取嚴格按照全血細胞DNA提取試劑盒說明書〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存備用。

1.4.2聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)進行SNPs分型從文獻中查找 rs3219489位點[7]和 rs10527342位點[5]引物(見表1)，均在GeneBank中進行序列比對驗證。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應體系：雙蒸水(ddH2O)4.625 μl，2×Masteer Mix 6.25 μl，DNA聚合酶0.125 μl，上游引物0.25 μl，下游引物0.25 μl，DNA 1.0 μl。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃/63 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環35次；72 ℃總延伸10 min。采用RsaⅠ和AluYb8 限制性內切酶(NEB公司)分別對rs3219489、rs10527342位點PCR產物進行酶切，酶切產物經3.0%瓊脂糖凝膠電泳后用Gel Doc-2000凝膠成像系統觀察條帶分布來判斷基因型。隨機抽取30例樣本進行兩個位點的PCR-RFLP重復試驗，保證酶切結果的正確性。每種基因型各挑選2例患者，經PCR擴增后進行測序驗證，以確保基因分型的準確性。

1.5SCD試驗采用SCD試驗檢測兩組精子DNA損傷程度。計數300個精子，觀察精子光暈大小，根據精子光暈與精子頭橫徑的比例，分為大、中、小和無光暈4個等級：大光暈：>2/3精子頭橫徑，中光暈：>1/3～2/3精子頭橫徑，小光暈：≤1/3精子頭橫徑。大光暈和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小光暈和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。精子DNA損傷程度采用精子DNA斷裂指數(DNA fragment index,DFI) 表示，DFI=(小光暈精子數+無光暈精子數)/精子總數×100%。

2　結果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗對照組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2值分別為1.23和1.09，P>0.05)，說明本研究所選的樣本具有群體代表性。2.2對照組與病例組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點基因型分布和等位基因頻率比較對照組與病例組MUTYH基因rs3219489位點GG、CG、CC基因型分布比較,差異無統計學意義(P>0.05)；CG+CC基因型頻率，G、C等位基因頻率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。在顯性遺傳模型下，攜帶CG+CC基因型個體患原發性男性不育癥的風險是攜帶GG型個體的0.69倍〔OR=0.69，95%CI(0.49，0.96)〕；攜帶C等位基因個體患原發性男性不育癥的風險是攜帶G等位基因個體的0.75倍〔OR=0.75，95%CI(0.59，0.95)〕。對照組與病例組MUTYH基因rs10527342位點AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.3對照組、少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點基因型分布和等位基因頻率比較對照組、少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組MUTYH基因rs3219489位點GG、CG、CC基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)；CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異有統計學意義(P<0.05)；其中精液指標正常亞組MUTYH基因rs3219489位點CG+CC基因型頻率和C等位基因頻率低于對照組和少精弱精癥亞組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組與少精弱精癥亞組MUTYH基因CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。攜帶CG+CC型個體患精液指標正常男性不育癥的風險是攜帶GG型個體的0.50倍〔OR=0.50,95%CI(0.30，0.82)〕；攜帶C等位基因個體患精液指標正常男性不育癥的風險是攜帶G等位基因個體的0.56倍〔OR=0.56，95%CI(0.38，0.82)〕。對照組、少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組MUTYH基因rs10527342位點AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05，見表3)。

2.4各組精子DFI比較病例組精子DFI〔(46.2±22.3)%〕高于對照組〔(21.4±9.2)%〕，差異有統計學意義(t=7.01，P<0.05)。對照組、少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組精子DFI比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組精子DFI高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；少精弱精癥亞組精子DFI高于精液指標正常亞組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表1　MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點SNPs分型基本信息

注：引物序列中的小寫字母為人工引入的錯配堿基；rs10527342位點是由326 bp的AluYb8元件反向插入MUTYH基因第15內含子中形成，是一種插入/缺失變異(A→P)

表2　對照組與病例組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表3對照組、少精弱精癥亞組與精液指標正常亞組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table 3Comparison of genotype distribution and allele frequency of MUTYH rs3219489 and rs10527342 among control group,oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup

組別例數rs3219489位點基因型GG CG CC CG+CC 等位基因G Crs10527342位點基因型AA AP PP AP+PP 等位基因A P對照組329123(37.4)153(46.5)53(16.1)206(62.6)399(60.6)259(39.4)94(28.6)159(48.3)76(23.1)235(71.4)347(52.7)311(47.3)少精弱精癥亞組16671(42.8)72(43.4)23(13.8)95(57.2)214(64.5)118(35.5)49(29.5)83(50.0)34(20.5)117(70.5)181(54.5)151(45.5)精液指標正常亞組 79 43(54.4)30(38.0)6(7.6)36(45.6)ab116(73.4)43(26.6)ab16(20.3)46(58.2)17(21.5)63(79.7)78(49.4)80(50.6)χ2值8.977.858.583.472.591.14P值0.060.020.010.480.270.57

注：與對照組比較，aP<0.05；與少精弱精癥亞組比較，bP<0.05

Table 4Comparison of sperm DFI among control group,oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup

組別例數精子DFI對照組6721.4±9.2少精弱精癥亞組16650.0±22.1a精液指標正常亞組7938.2±20.7abF值32.80P值<0.01

注：DFI=DNA斷裂指數；與對照組比較，aP<0.05；與少精弱精癥亞組比較，bP<0.05

2.5原發性男性不育癥患者MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點不同基因型間精子 DFI 比較MUTYH基因rs3219489位點GG、CG、CC基因型原發性男性不育癥患者精子 DFI 比較,差異無統計學意義(P>0.05，見表5)；MUTYH基因rs10527342位點AA、AP、PP基因型原發性男性不育癥患者精子 DFI 比較,差異無統計學意義(P>0.05，見表6)。

2.6MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點遺傳易患性分析及其與吸煙、飲酒的交互作用采用Haploview軟件分析MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點的單體型，結果顯示，MUTYH基因rs3219489位點與rs10527342位點間存在中度連鎖不平衡(D′=0.749，r2=0.289)。采用單純病例研究，將研究對象按照基因型和環境因素進行分組，探討基因-環境交互作用對原發性男性不育癥患病風險的影響，結果顯示，MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點與吸煙、飲酒均不存在交互作用(P>0.05，見表7)。

表7　 MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點與吸煙、飲酒對原發性男性不育癥發病影響的交互作用(例)

注:a數據有刪失，表中數據剔除刪失數據

Table 5Comparison of sperm DFI among GG,CG and CC genotypes of MUTYH rs3219489 of patients with primary male infertility

基因型例數精子DFIGG11444±21CG10250±24CC2941±21F值0.32P值0.73

Table 6Comparison of sperm DFI of AA,AP and PP genotypes of MUTYH 10527342 of patients with primary male infertility

基因型例數精子DFIAA6543±19AP12948±24PP5146±22F值0.40P值0.68

3　討論

人精子染色質由DNA雙鏈和魚精蛋白結合而形成高度濃縮的結構，易受到遺傳或吸煙、飲酒等環境因素的損傷，是影響男性不育的重要因素之一[7]。人類DNA損傷修復系統主要包括：錯配修復通路、堿基切除修復通路、核酸切除修復通路及雙鏈斷裂修復通路等[8]。MUTYH 基因定位于 1p32.1～1p34.3 ，長7.1 kb，含有16個外顯子，編碼一個535個氨基酸的蛋白[9]，MUTYH是堿基切除修復通路的關鍵蛋白，是一種特異的腺嘌呤轉葡糖基酶，定位于細胞核和線粒體內[10]。復制DNA后MUTYH迅速掃描子鏈 DNA，切除子鏈DNA中與母鏈8-OHdG錯配的A[11]。MUTYH基因功能的異常會導致低效的DNA修復和8-OHdG的積累，造成DNA損傷。如果MUTYH 失活，則會因8-OHdG的異常積累引起G∶C→T∶A的堿基置換，從而引起相關基因及其蛋白發生功能性改變[12]。研究證實，rs3219489 (G→C，Gln324His)位點CC基因型會增加瑞典人群和日本人群直腸癌的患病風險[13]，提示rs3219489位點可能會導致遺傳不穩定性。rs10527342位點是由AluYb8元件反向插入MUTYH基因第15內含子中形成的一個常見變異[14]。AluYb8 MUTYH 突變純合子或雜合子個體基因組中8-OHdG水平顯著高于野生純合子，并且是中國人群2型糖尿病的危險因素[15]，提示該位點可導致MUTYH的功能異常。大量證據表明，MutY糖基化酶同系物(MUTYH)在許多癌癥的發病機制中扮演著重要角色[16]，并且MUTYH基因多態性是類風濕關節炎的危險因素[17]。2型糖尿病、腫瘤、風濕性關節炎以及男性不育等均是復雜的多基因疾病，受環境和遺傳因素影響[18-21]。故推測MUTYH 基因的多態性可能會影響精子DNA完整性及原發性男性不育癥。

rs3219489位點位于MUTYH基因的編碼區[22]，其G/C等位基因的變化可以直接影響蛋白質的功能，因此可以產生嚴重的表型后果[23-24]。CZARNY等[25]研究表明,rs3219489位點GG基因型增強遲發性復發類型的風險。CAI等[26]研究發現，rs3219489位點GG基因型、rs10527342位點均增加終末期腎臟疾病的風險，而CC基因型增加患直腸癌的風險[27]，本研究結果顯示，MUTYH 基因rs3219489位點與原發性男性不育癥有關，攜帶CG+CC型個體患原發性男性不育癥的風險較攜帶GG型個體低，攜帶C等位基因個體患原發性男性不育癥的風險較攜帶G等位基因個體低；MUTYH 基因rs3219489位點與精液指標正常男性不育癥有關，攜帶CG+CC型個體患精液指標正常男性不育癥風險較攜帶GG型的個體低。G、C等位基因頻率分布在精液指標正常亞組與對照組和少精弱精癥亞組中亦有差異，攜帶C等位基因個體患精液指標正常男性不育癥的風險是攜帶G等位基因個體的0.56倍，提示MUTYH 基因rs3219489位點的C等位基因可能是原發性男性不育癥的保護因素；但是MUTYH 基因rs3219489位點3種不同基因型個體間精子DFI并無差異，提示MUTYH 基因rs3219489位點可能是通過更復雜的機制參與原發性男性不育癥的發病過程。本研究探討MUTYH 基因rs3219489位點與原發性男性不育癥的遺傳易患性，還需更多的研究來驗證。MUTYH 基因rs10527342位點的變異基因型(PP和AP)并不會對原發性男性不育癥的遺傳易患性和精子DFI產生影響，同時，其與吸煙和飲酒也無交互作用。此位點還有待于在不同地區、不同人群中驗證，進一步明確二者之間的關系。

本研究SCD試驗結果表明，病例組患者精子 DFI 高于對照組，提示精子DFI的增加可能會增加原發性男性不育癥的患病風險。精子DNA完整性降低不僅會影響精子的活力，導致流產[28]，還會降低輔助生殖技術治療的受精率和優質胚胎率[29]。此外，嚴重的精子DNA損傷還和輔助生殖技術成功率低有關[30]。因此，精子DNA完整性降低不僅可降低男性生育力，也會影響后續的輔助生殖治療結果。

綜上所述，精子DNA損傷修復是多基因、多步驟、多通路的復雜過程，同時與環境因素有關，雖然MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點對原發性男性不育癥的發病沒有貢獻，可能對精子DNA完整性沒有影響，但此基因可能是微效基因，與其他相關基因的交互可能與原發性男性不育癥相關。此外，本研究選取的研究對象是中國北方寧夏地區人群，證實了MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點SNPs與本地區原發性男性不育癥的發病無關，但可能只能反映寧夏地區人群的特征，此位點SNPs與不同人種、不同地區原發性男性不育癥是否相關，有待于不同人群、多地區的研究證實。

作者貢獻：申琴進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；申琴、馬強、劉春蓮進行試驗實施、評估、資料收集；焦海燕進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of MUTYH Gene Polymorphisms on Primary Male Infertility and Sperm DNA Integrity

SHENQin，MAQiang，LIUChun-lian，JIAOHai-yan.

KeyLaboratoryofFertilityMaintainingoftheMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Correspondingauthor：JIAOHai-yan,KeyLaboratoryofFertilityMaintainingoftheMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；E-mail：hyjiao1602@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of two SNPs (rs3219489 and rs10527342) of MUTYH gene on primary male infertility and sperm DNA integrity and their interaction with smoking and alcohol consumption.Methods245 primary male infertile patients who received treatment in the Outpatient Department of the Center for Reproductive Medicine in the General Hospital of Ningxia Medical University from August 2011 to December 2012 were selected as case group,including 166 patients with oligoasthenospermia (oligoasthenospermia subgroup) and 79 patients with normozoospermia male infertility (normozoospermia subgroup),and 329 healthy males with reproductive history from the physical examination of the hospital in the same period were selected as control group.PCR-RFLP was employed to analyze the genotype distribution and allele frequency of MUTYH rs3219489 and rs10527342.The damage degree of DNA was determined by sperm chromatin dispersion and was manifested by sperm DNA fracture index (DFI).ResultsControl group and case group were not significantly different in the distribution of GG,CG and CC genotypes of MUTYH rs3219489 (P>0.05),but were significantly different in the frequency of CG+CC genotype and G and C allele frequency (P<0.05).Control group and case group were not significantly different in the distribution of AP,AP and PP genotypes,the frequency of AP+PP genotype and the A and P allele frequency of MUTYH rs10527342(P>0.05).Control group,oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup were not significantly different in the distribution of GG,CG and CC genotypes of MUTYH rs3219489 (P>0.05),but were significantly different in the frequency of CG+CC genotype and the G and C allele frequency (P<0.05).The three groups were not significantly different in the distribution of AA,AP and PP genotypes,the frequency of AP+PP genotype and the A and P allele frequency of MUTYH rs10527342(P>0.05).Case group was higher than control group in sperm DFI〔(46.2±22.3)% vs.(21.4±9.2)%〕(P<0.05).Oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup were higher than control group in sperm DFI,and oligoasthenospermia subgroup was higher than normozoospermia subgroup in sperm DFI (P<0.05).There were no significant differences in sperm DFI among patients with different genotypes of MUTYH rs3219489 and rs10527342 (P>0.05).Moderate linkage disequilibrium existed between MUTYH rs3219489 and rs10527342 (D′=0.749，r2=0.289).There were no interaction of MUTYH rs3219489 and rs10527342 with smoking and alcholic consumption (P>0.05).ConclusionC allele of MUTYH rs3219489 may be a protective factor for primary male infertility,and MUTYH rs10527342 may have correlation with primary male infertility.The increase of sperm DFI may cause the increase in the risk of primary male infertility,and rs3219489 and rs10527342 may have no correlation with the integrity of sperm DNA and have no interaction with smoking and alcoholic consumption.

Infertility,male；MUTYH gene；Polymorphism,single nucleotide；Spermatozoa；DNA

寧夏回族自治區自然科學基金資助項目(NZ14070)

750004寧夏銀川市，寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室，醫學遺傳學與細胞學系(申琴，焦海燕)；川北醫學院附屬醫院檢驗科(馬強)；寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心(劉春蓮)

焦海燕，750004寧夏銀川市，寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室，醫學遺傳學與細胞學系；

E-mail：hyjiao1602@hotmail.com

R 698.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.30.012

2016-03-24；

2016-08-12)