Gli-1、Smo蛋白在術(shù)前化療與未化療肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

王佳瑞　鄭賢波　李　明　馬　玥　于　洋　聶慧玲

（大連市第五人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116021）

Gli-1、Smo蛋白在術(shù)前化療與未化療肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

王佳瑞鄭賢波李明馬玥于洋聶慧玲

（大連市第五人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116021）

目的 為了探討Gli-1和Smo蛋白在術(shù)前化療和未化療肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 通過Western Blot、RT-PCR法分別檢測40例術(shù)前化療，60例術(shù)前未化療肺癌患者的組織及50例癌旁組織中Gli-1和Smo的蛋白和核酸水平的表達(dá)情況，并分析Gli-1和Smo蛋白在術(shù)前化療和未化療肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。結(jié)果 未化療和術(shù)前化療緩解的肺癌組織中Gli-1和Smo的表達(dá)無論在蛋白水平還是核酸水平均明顯高于癌旁正常組織；經(jīng)過化療緩解的肺癌組織標(biāo)本兩種蛋白的表達(dá)明顯下降。結(jié)論 Sonic Hedgehog信號傳導(dǎo)通路在肺癌中有異常激活，檢測肺癌組織中Gli-1和Smo的表達(dá)水平可能為肺癌的早期診斷提供依據(jù)，此外兩種蛋白可能成為監(jiān)測肺癌患者病情變化和化療反應(yīng)的生物學(xué)指標(biāo)。

Gli-1；Smo；肺癌

肺癌目前已經(jīng)成為全球病死率最高的惡性腫瘤。近年來研究表明多條通路設(shè)為異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，最新研究證實(shí)Sonic Hedgehog信號傳導(dǎo)通路在乳腺癌，大腸癌，食道癌，胰腺癌中起著重要作用［1-2］。之前我們研究表明Gli-1和Smo在肺癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織，兩種蛋白在肺癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、侵襲范圍及臨床分期顯著相關(guān)［3-4］。本研究除了研究兩種蛋白在未化療肺癌組織中的表達(dá)外，還進(jìn)一步研究其在術(shù)前化療肺癌組織中的表達(dá)，從而探討兩種蛋白在肺癌治療中的意義。

1　材料與方法

1.1一般資料：收集大連市第五人民醫(yī)院2008年～2014年手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)肺癌為手術(shù)標(biāo)本100例，其中術(shù)前化療緩解的肺癌標(biāo)本40例，術(shù)前未經(jīng)放化療的肺癌標(biāo)本60例，同時選取50例癌旁組織作為對照組。

1.2研究方法

1.2.1材料：Gli-1、Smo單抗購自美國Epitomics公司；凱基全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司；Western blotting BCA蛋白定量試劑盒、配膠試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、PVDF膜均購自江蘇碧云天公司；Trizol、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq酶、DNA Marker購自TaKaRa（大連寶生物）公司。

1.2.2Western blot檢測Gli-1、Smo蛋白表達(dá)：按照凱基全蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，BCA法定量。上樣量40 μg，采用10%SDSPAGE凝膠電泳分離，采用濕法轉(zhuǎn)膜（1 kD/min）至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1 h。后加入一抗（1∶200），BST洗膜后加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光。用Quantity-One軟件對條帶的吸光度值進(jìn)行半定量分析，以目的蛋白條帶的吸光度值/內(nèi)參β-actin度值的比值表示目的蛋白的相對量。

1.2.4RT-PCR檢測Gli-1、Smo mRNA的表達(dá)：按照Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃4 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio-Rad凝膠成像儀成像，Quantity-One軟件對條帶吸光度值進(jìn)行半定量分析，以目的條帶吸光度值/內(nèi)參條帶吸光度值的比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理：所有實(shí)驗均重復(fù)3次以上，實(shí)驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS17.0軟件處理，單因素方差分析比較多組間均數(shù)的差異，以P＜0.05表示有顯著性差異。

2　結(jié)　果

2.1 Gli-1、Smo在未化療及已化療肺癌組織及癌旁組織中Western Blot檢測結(jié)果。Gli-1在未化療肺癌組織中，化療后肺癌組織及癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為（0.86±0.16）、（0.54±0.08）、（0.34± 0.07），三者間有顯著差異（P＜0.05）。Smo在未化療肺癌組織中的表達(dá)（0.64±0.12）明顯高于化療后肺癌組織（0.47±0.10）及癌旁組織（0.24±0.05），三者間有顯著差異（P＜0.05）。見表1。

表1　Gli-1、Smo在未化療及已化療肺癌組織及癌旁組織中Western Blot檢測結(jié)果

表1　Gli-1、Smo在未化療及已化療肺癌組織及癌旁組織中Western Blot檢測結(jié)果

注：與肺癌未化療組相比較，aP＜0.05；與肺癌已化療組相比較，bP＜0.05

組別Gli-1Smo肺癌未化療組0.86±0.160.64±0.12肺癌已化療組0.54±0.08a0.47±0.10a癌旁組織0.34±0.07ab0.24±0.05ab

2.2Gli-1、Smo RT-PCR檢測結(jié)果：Gli-1在未化療肺癌組織中，化療后肺癌組織及癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為（0.92±0.15）、（0.64± 0.11）、（0.24±0.09），三者間有顯著差異（P＜0.05）。Smo在未化療肺癌組織中的表達(dá)（0.62±0.09）明顯高于化療后肺癌組織（0.42± 0.06）及癌旁組織（0.21±0.08），三者間有顯著差異（P＜0.05）。見表2。

表2　Gli-1、Smo在未化療及已化療肺癌組織及癌旁組織中RT-PCR檢測結(jié)果

表2　Gli-1、Smo在未化療及已化療肺癌組織及癌旁組織中RT-PCR檢測結(jié)果

注：與肺癌未化療組相比較，aP＜0.05；與肺癌已化療組相比較，bP＜0.05

組別Gli-1Smo肺癌未化療組0.92±0.150.62±0.09肺癌已化療組0.64±0.11a0.42±0.06a癌旁組織0.24±0.09ab0.21±0.08ab

3　討　論

Sonic Hedgehog信號傳導(dǎo)通路與胚胎的發(fā)生、發(fā)育密切相關(guān)，除此研究表明其在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中也起著重要的作用。其主要由Hh配體，膜蛋白受體Ptch、Smo和下游轉(zhuǎn)錄因子Gli組成。楊鐸等研究表明Sonic Hedgehog信號通路可能參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展［5-6］。

本研究對未化療，術(shù)前已化療和癌旁組織中Gli-1和Smo兩種蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示未化療和經(jīng)過化療緩解的肺癌組織中Gli-1和Smo的表達(dá)無論在蛋白水平還是核酸水平均明顯高于癌旁正常組織；結(jié)果提示：Sonic Hedgehog信號傳導(dǎo)通路在肺癌中有異常激活，檢測肺癌組織中Gli-1和Smo的表達(dá)水平可能為肺癌的早期診斷提供依據(jù)。本研究結(jié)果還顯示經(jīng)過化療緩解的肺癌組織標(biāo)本兩種蛋白的表達(dá)明顯下降。提示Gli-1和Smo可能成為監(jiān)測肺癌患者病情變化和化療反應(yīng)的生物學(xué)指標(biāo)。兩種蛋白在肺癌中的高表達(dá)為肺癌分子生物治療靶向治療提供了的理論依據(jù)。

［1］ Bray F，Ren J-S，Masuyer E，et al.Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008［J］.Int J Cancer，2013，132（5）:1133-1145.

［2］ Trimboli AJ，Cantemir-Stone CZ，Li F，et al.Pten in stromal fibroblasts suppresses mammary epithelial tumours［J］.Nature，2009，461（7267）: 1084-1091.

［3］ 黃美歐，姚洪瑩，劉濤，等.Gli-1在肺癌患者的癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國民康醫(yī)學(xué)，2015，27（9）:83-84.

［4］ 姚洪瑩，黃美歐，劉濤.程謨朝.Smo在肺癌患者的癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國民康醫(yī)學(xué)，2015，27（10）:70-71.

［5］ 楊鐸，臧東鈺，李曉明.Shh 蛋白及其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（11）:1182-1184.

［6］ Watkins DN，Berman DM，Burkholder SG，et al.Hedgehog signalling within airway epithelial progenitors and in small-cell lungCancer［J］.Nature，2003，422（6929）:313-317. 400 mg/m2，于首次給藥間隔28 d再給藥1次，周而復(fù)始，持續(xù)治療4個

R734.2

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1671-8194（2016）29-0165-02