SAMHD1抗腫瘤的作用機制

劉盼盼 翟辰洋 高文英 王少華 于曉方

(吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

SAMHD1抗腫瘤的作用機制

劉盼盼 翟辰洋 高文英 王少華 于曉方

(吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

目的 通過測定結腸癌中SAMHD1 (109aa-626aa)相關突變體的表達情況探索其在抗腫瘤方面的作用。方法 選擇SAMHD1 (109aa-626aa)在結腸癌中的5個典型突變體檢測它們的表達量、活力大小及被Vpx降解的情況。結果 所選擇的SAMHD1 (109aa-626aa)的5種突變體在結腸癌中的表達量、活力大小均有統計學差異(P<0.05)。結論 與野生型相比SAMHD1(109aa-626aa)在結腸癌中的表達量下調、活力降低，更有利于腫瘤的發生。

SAMHD1；dNTP；結腸癌；酶活

SAMHD1是一種由626 個氨基酸組成的核蛋白，其主要包含有N-端核定位信號區(NLS)、不育α基序(SAM)結構域、組氨酸 /天冬氨酸殘基(HD)結構域、T592磷酸化位點〔1～3〕以及C-端可變區(Vpx結區)〔4，5〕。HD區域是由組氨酸和天冬氨酸交替排列而成(H…DH…D)的基序〔6〕，它不僅可以參與核苷酸代謝〔7〕，同時其還具有 dNTPase 及 RNase 活性。C端的多變區能與病毒蛋白X(Vpx)〔8〕的α螺旋結構域相互結合，誘導Vpx〔9〕蛋白對自身的降解。過去研究人員只注意到了SAMHD1的抗病毒作用，但目前SAMHD1(109aa-626aa)的突變體在人類的幾種癌癥中已經得到證實〔10～18〕，主要包括慢性淋巴細胞白血病(CLL)〔10，12，15〕、骨髓瘤〔17〕、乳腺癌〔16〕、肺癌〔13〕、結腸癌和直腸癌〔16，18，19〕、胰腺癌〔11〕、膠質母細胞瘤〔14〕和皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。CLCL主要發生于老年人群中，表現出臨床和生物異質性。本文主要對結腸癌中SAMHD1(109aa-626aa)的突變體進行相關的研究。

1 對象和方法

1.1 對象 從結腸癌的活性中心和變構中心選擇5個突變體，分別是V133I、K288T、A338T、R366H、D497Y，同時選擇它們的野生型SAMHD1(109aa-626aa)(WT)。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 從吉林大學第一醫院轉化醫學研究院獲得WT質粒，以此為模板構建5個突變體并用考馬斯亮藍(BB)染色。

1.2.2 原核表達 將構建完成的質粒轉化到原核細胞大腸桿菌中，誘導表達后收獲細胞，將收獲的細胞破碎并純化所獲得的蛋白，經SDS電泳后比較它們表達量的差異。將純化的蛋白加上一定量的底物，反應一段時間后用高效液相色譜層析測量它們酶活力的差異。

1.2.3 真核表達 將構建好的質粒轉染到真核細胞中。其中實驗組除了轉染與SAMHD1(109aa-626aa)相關的質粒還需轉染Vpx。一段時間后收獲細胞，用Western印跡檢測sam以及相關的突變體，觀察其是否能被Vpx降解。

2 結 果

圖1 SAMHD1及其突變體在原核生物中的預表達情況

2.1 原核細胞中預表達結果 WT以及5個突變體在5 ml試管中用IPTG誘導后的表達情況如圖1所示。R366H在原核細胞中的可溶性最高，比WT略高，而V133I、K288T、A388T的可溶性比WT有不同程度的降低，其中可溶性最低的是D497Y，蛋白幾乎全部以包涵體的形式存在。說明所選擇的結腸癌中SAMHD1(109aa-626aa)5個突變體在原核細胞中都可以表達，只是所表達蛋白質的可溶性有所差異。

2.2 原核細胞中大量表達及純化結果 預表達的結果說明質粒構建正確并能在所轉化的細胞中表達，但還會有一些雜蛋白，因此需要擴大培養細菌并對所獲得的蛋白進行純化，盡可能的去除里面的雜蛋白，所得的電泳結果如圖2所示。預表達結果提示R366H可溶性最好，在純化表達中也提示，R366H的可溶性要高于其他突變體。V133I的可溶性比WT略低，而K288T、A338T、D497Y的純化結果表明它們的可溶性比較差，大部分蛋白以包涵體的形式表達在菌體中。這說明SAMHD1發生突變后，它的表達量會降低，即在結腸癌中由于SAMHD1發生了突變它的表達量與正常細胞相比較會有所降低。

2.3 WT及其突變體dNTPase活力的檢測 SAMHD1具有dNTPase活性，可以降解底物dNTP，用高效液相色譜檢測不同突變體不同時間降解產物的酶活力差異，突變體的酶活力在任一時間段基本都低于WT〔20〕。A338T和D497Y從一開始幾乎就完全喪失了酶活性，而K288T和R366H在3～12 h這一時間段還殘留一些酶活力，但在12 h以后，K288T的酶活力幾乎完全喪失，R366H則還有一些酶活力。V133I比較特殊，它的酶活力值與WT比只是稍微降低，表現出了非常高的酶活力。見圖3。

圖2 SAMHD1及其突變體在原核生物中的表達情況

圖3 SAMHD1及其突變體的酶活力變化情況

2.4 結腸癌相關SAMHD1(109aa-626aa)突變對Vpx對其降解的影響 我們轉染Vpx的實驗組和沒有轉染Vpx的對照組在轉染后48 h收獲菌液，經過Western印跡檢測。在Vpx存在的情況下，突變體和WT均發生了一定程度的降解。見圖4。

圖4 Vpx對SAMHD1及其突變體的降解情況

3 討 論

Clifford等〔10〕比較了在CLL中SAMHD1 mRNA表達量與正常B細胞中的差異，結果發現突變體中SAMHD1 mRNA的表達量明顯低于正常B細胞。 Wang等〔20〕研究了SAMHD1在肺癌中的表達情況，發現肺癌中SAMHD1的蛋白表達水平和mRNA的表達水平都會降低。de Silva等〔21〕比較了健康人和CTCL患者外周血單核細胞中SAMHD1 mRNA的表達情況，結果發現CTCL患者外周血單核細胞中SAMHD1的表達量明顯降低。SAMHD1在其他癌癥中的表達也明顯降低，如淋巴瘤、乳腺癌和各種腫瘤細胞系〔10〕。本研究說明不只是在中其表達量下調，在其他的各種癌細胞中SAMHD1的表達量基本都會有所下調，這可能是大多數腫瘤細胞的共同現象。SAMHD1在很多腫瘤中表達下調可能與SAMHD1啟動子的甲基化有關，但是具體的機制還不清楚，需要進一步的研究。

細胞內dNTP水平的平衡是維護細胞基因組完整性的關鍵，而dNTP的減少或不平衡會導致基因毒性并且增加突變，dNTP的增加通常導致不受控制的DNA復制，保真度降低并可以促進癌癥的發展〔15，16〕。SAMHD1是一種具有核酸酶和脫氧核糖核苷三磷酸水解酶(dNTPase)活性的雙功能酶〔3，22〕。因此它能夠水解dNTP，并以此來控制細胞內dNTP的水平，進而影響細胞周期進程和DNA的復制。

本研究中，結腸癌中SAMHD1的酶活性基本上均有所降低，而且除V133I外，其余的活性都非常低，基本上沒有多少活力。腫瘤細胞中dNTP的濃度相對而言非常高，SAMHD1 dNTPase活性的降低使結腸癌中dNTP水解量減少，有利于腫瘤細胞的快速復制。也有可能是由于SAMHD1的突變使得細胞中dNTP大量增加，進而引發癌變。本研究結果表明在結腸癌中SAMHD1發生突變后確實會影響它的dNTPase活性，而且一般情況是負面影響其酶活性。在腫瘤細胞中dNTP的含量相對比較高，由于SAMHD1發生了突變，使其酶活力降低，從而降解dNTP的能力會下降，這樣就使得細胞中一直維持高濃度的dNTP，有利于癌細胞的快速增殖。在酶活力的檢測實驗中，除V133I外，其余4種突變體的酶活力幾乎全部喪失，這可能是由于V133I這一突變點的突變并沒有引起SAMHD1構象的變化，因此，其酶活力并沒有受到多大影響。但其余4種突變體，可能都在催化中心或其他區域，在催化中心某個氨基酸的改變都有可能造成SAMHD1某些功能的喪失，因此它們的突變導致了其酶活性的大幅度降低。

有研究結果證明，Vpx可以引發SAMHD1泛素化并且能夠使其發生蛋白酶體的降解。本研究結果說明與結腸癌相關的所有的SAMHD1突變體依然可以被Vpx降解，這與之前的研究一致〔23，24〕。Vpx對SAMHD1的降解主要依賴于其C端(595aa-626aa)及催化區域(HD結構域)，我們所選擇的這些突變體的突變位點并不在Vpx降解的關鍵區域。

SAMHD1具有的dNTPase功能是dNTP穩態通路的關鍵調節劑〔25，26〕，其可以水解細胞內的dNTP，使細胞內的dNTP維持較低的水平，能夠減少細胞增殖，而且SAMHD1的dNTPase活性對于預防先天性和自身免疫病非常重要〔4〕。SAMHD1 在幾種癌癥中的突變或下調暗示它是一種潛力腫瘤抑制基因〔27〕。因此，通過一定的方式恢復SAMHD1在癌細胞中的表達，也可以成為癌癥治療的一個手段。盡管SAMHD1結構和功能的研究快速進展，但是它調節癌細胞生長和增殖的準確的作用和機制仍需要我們進一步去研究。

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〔2017-03-09修回〕

(編輯 郭 菁)

于曉方(19-)，男，博士生導師，教授，主要從事分子病毒學研究。

劉盼盼(1989-)，男，在讀碩士，主要從事分子病毒學研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2656-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.024