益腎化濕顆粒治療大鼠糖尿病腎病中ERK表達及意義

趙毓芳　董科

[摘要] 目的 探討益腎化濕顆粒在治療大鼠糖尿病腎病中的ERK表達及其意義。方法 將40只SD（Sprague-Dawley）大鼠隨機分為正常對照組（N組）、糖尿病腎病組（DN組）、益腎化濕顆粒治療組（DN+Y組）、貝那普利治療組（DN+B組）。對照組用等量檸檬酸緩沖液腹腔注射，糖尿病腎病組和各治療組制備糖尿病模型，取血檢測血糖（GLU）、血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量，以免疫組化方法檢測各組腎組織p-ERK1/2表達及其意義。 結果 治療后8周，DN組大鼠血糖明顯升高，血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24h尿蛋白定量等指標與N組相比明顯升高，二者差異有統計學意義（P<0.05）；DN組腎組織內p-ERK1/2的表達與N組相比明顯增高，二者差異有統計學意義（P<0.05）；其他治療組的血糖、SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、p-ERK1/2表達等指標與DN組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 在糖尿病腎病的產生、發展過程中，ERK參與其中，其表達增加可能對DN的進一步發展造成影響；益腎化濕顆粒能夠對DN大鼠腎皮質中ERK的活性予以有效限制，從而對DN腎臟起到一定的保護作用，這說明益腎化濕顆粒在糖尿病腎病的治療中表達明顯，具有較高的臨床應用價值。

[關鍵詞] 益腎化濕顆粒；糖尿病腎??；細胞外信號調節激酶

[中圖分類號] R587.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-4062（2016）02（b）-0052-04

糖尿病是當前在臨床上一種發生幾率較高的慢性代謝性疾病，影響患者的日常生活，甚至對生命健康直接造成威脅，而糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN） 則是該病諸多并發癥中最為嚴重的一種[1]。DH的臨床癥狀集中變現為早期水腫、高血壓，晚期腎功能損害[2]。由于目前糖尿病的發病率高居不下，且愈演愈烈之勢，針對糖尿病腎臟疾病的臨床研究與診治已經刻不容緩，然而當前學界關于DN的具體發病機制依然沒有達成一致共識。一般認為，DN的發生可能與包括細胞因子、糖脂異常代謝活動、生長因子等諸多綜合因素的影響作用有關[3]。近年來的文獻報道顯示，胞外信號調節激酶（ERK）與DN之間存在密切關聯；同時學界也開始嘗試探討益腎化濕顆粒在DN臨床上的療效及其病理表達[4]。該次實驗通過研究益腎化濕顆粒治療大鼠糖尿病腎病中ERK表達及意義，取得了一定成效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠 40 只，6～8周齡，體重（200±20）g。

1.1.2 試劑 p-ERK1/2 （Thr202/Tyr204）多克隆抗體。益腎化濕顆粒，廣州康臣藥業有限公司生產，生產批號040930，國藥準字Z20090250，規格： 10 g/袋×9袋。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組 40只SD大鼠飼養一周后，隨機抽取10只為正常對照組（N組），喂養普通飼料；其余30只喂養高糖高脂飼料，30 d后予以腹腔注射50 mg鏈脲佐菌素（STZ）造成糖尿病模型，連續兩次血糖≥16.7 mmol/L者即為造模成功。30只大鼠分為糖尿病腎病組（DN組）、益腎化濕顆粒治療組（DN+Y組）、貝那普利治療組（DN+B組）各10只。對糖尿病組和各治療組制備糖尿病模型，對照組則用等量檸檬酸緩沖液腹腔注射。成模后各治療組大鼠每天分別用益腎化濕顆粒溶液[150 mg/（kg·d）]、貝那普利水溶液（濃度為0.11%）按10 mg/（kg·d）的劑量進行治療性灌胃，對照組和糖尿病腎病組用等量生理鹽水灌胃。所有大鼠實驗期間均食用標準飼料，自由飲水，不使用胰島素和其他降糖藥物，連續觀察8周后收集標本[5-6]。

1.2.2 標本留取 觀察8周后稱體重，留24 h尿，24 h 尿蛋白（mg） = 24 h尿量（mL）×尿蛋白含量（g/L）。經乙醚麻醉后，采血，抗凝分離血漿，留待檢測。迅速打開腹腔，游離并摘除雙腎，稱取腎重，左腎去包膜后，切取10 mm3組織塊，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃保存；常規石蠟包埋，4 μm切片，予以HE染色、PAS染色；切取1 mm3組織塊，放入0.25%戊二醛溶液中，4 ℃保存[7]。

1.2.3 觀察指標 P-ERK1/2表達、腎功能指標（包括血糖GLU、血清肌酐SCr、血清尿素氮BUN、24 h尿蛋白定量）。

1.3 統計方法

應用SPSS 19.0統計軟件進行數據統計處理，以均數±標準差（x±s）表示計量資料，兩組均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 對血糖（GLU）的影響

治療8周后，DN組大鼠的血糖（22.17±1.03）mmol/L與N組（4.88±0.26）mmol/L相比明顯升高，二者差異有統計學意義（P<0.05）；各治療組大鼠血糖在數值上與DN組相比較低，但組組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。

2.2 對SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的影響

治療8周后，DN組大鼠的SCr（132.41±7.42）μmol/L、BUN（126.24±3.78）mmol/L、24 h尿蛋白定量（25.57±2.13）mg/24 h與N組相比明顯升高，二者差異有統計學意義（P<0.05）；各治療組大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量與N組相比明顯降低，分組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；DN+Y組與 DN+B組相關指標對比分析，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3 大鼠腎組織p-ERK1/2的免疫組織化學分析

治療8周后，腎組織中p-ERK1/2陽性表達部位呈現明顯的棕褐色或棕黃色顆粒，p-ERK1/2在各組大鼠腎小球和腎小管均有明顯表達，p-ERK1/2 陽性表達主要位于腎實質細胞胞核及胞漿內，與N組相比，DN組4周（41.36±3.13）及8周（46.17±4.26）的pERK1/2 表達明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01） ，其中8周表達較4周明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05） 。其他治療組在第4、8周的p-ERK1/2與DN組相比差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

3 討論

糖尿病是當前在臨床上一種發生幾率較高的慢性代謝性疾病，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 則是糖尿病中一種最為嚴重的并發癥。當前學界關于DN的具體發病機制依然沒有達成一致共識，這是由于DN的病因較為復雜。一般認為，DN的發生是多種因素綜合作用的結果，包括腎臟血流動力學的變化、血管活性物質、細胞因子、糖脂異常代謝活動等，在多種因素的影響作用下，腎小球細胞中的信號轉錄通路會隨之產生一定的變化[8-9]。目前學界已經逐漸認識到，在DN的發生與發展過程中，胞外信號調節激酶（ERK）通路的激活發揮著重要作用，國外已有學者證實了在糖尿病腎病腎纖維化的發生發展過程中，ERK1/2 的表達及其活化參與了整個過程。這說明，ERK在研究DN的發病機制方面具有重要的理論價值與參考意義。此外，近年來學界在DN的臨床診治研究進程中逐漸發現中藥復方在治療該病癥上所具有的較高價值[10-11]，其中益腎化濕顆粒，經相關文獻報道已經證實該藥物治療方式能夠有效緩解DN患者的臨床癥狀，通過對炎癥予以及時抑制，進而幫助患者早日康復。然而，目前學界對于益腎化濕顆粒在治療大鼠糖尿病腎病中的ERK表達及其意義相關問題依然缺乏深入、有效的研究分析。

ERK是細胞信號中對絲裂原信號進行傳遞作用中所需要的關鍵性激酶，當ERK被激活之后，通過轉位到胞核的作用，ERK能夠實現對于轉錄因子活性的有效調節，進而產生一系列的細胞效應。最新研究成果顯示，ERK將系膜細胞激活之后，將會直接造成ECM分泌顯著增加、細胞肥大，進而參與DN細胞的基質積聚活動。從中醫的角度看來，糖尿病腎病的病因在于“腎氣虛衰，消渴日久，氣化失?！保虼瞬捎弥兴帍头降乃幬镏委煼绞?，能夠對腎組織ERK信號通路起到積極影響作用，通過影響腎臟MCP-1、 TNF-α mRNA水平達到對早期DN予以有效防止的效果[12]。

該次研究結果顯示，DN組大鼠血糖（GLU）、血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量等指標與N組相比明顯升高，二者差異有統計學意義（P<0.05）；其他治療組的相關指標與DN組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。這說明，益腎化濕顆粒在治療大鼠糖尿病腎病中具有ERK高表達，益腎化濕顆粒對于TGF-β1mRNA和PDGF-BmRNA的過度表達、腎臟肥大、細胞外基質極具等情況可能存在一定的下調影響，由于P-ERK1/2可能參與了早期DN的發生、發展進程，因此益腎化濕顆?？赡苁峭ㄟ^對ERK的活性予以抑制來實現對于腎臟的保護作用。

綜上所述，在糖尿病腎病的產生、發展過程中，ERK參與其中，其表達增加可能對DN的進一步發展造成影響；益腎化濕顆粒能夠對DN大鼠腎皮質中ERK的活性予以有效限制，從而對DN腎臟起到一定的保護作用，這說明益腎化濕顆粒在糖尿病腎病的治療中表達明顯，具有較高的臨床應用價值。

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（收稿日期：2015-11-06）