葡萄糖轉運蛋白1、血管內皮生長因子及增殖細胞

張欣 吳立平 康保潔

[摘要] 目的 探討葡萄糖轉運蛋白1（Glut1）、血管內皮生長因子（VEGF）與增殖細胞核抗原（PCNA）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達和相關性。 方法 研究標本取自濰坊市人民醫院胸外科2013年8月～2015年6月期間住院行肺部手術的患者113例，其中93例NSCLC組織作為實驗組，20例肺部良性病變組織作為對照組，采用免疫組化法檢測Glut1、VEGF及PCNA在NSCLC組織和肺部良性病變組織中的表達，并分析其與NSCLC臨床病理學參數間的關系及三者間的相關性。 結果 實驗組中Glut1、VEGF陽性率及PCNA標記指數（PCNA-LI）分別為89.25%（83/93）、80.65%（75/93）和（67.65±26.11）%，均高于對照組[15.00%（3/20）、25.00%（5/20）和（25.25±9.34）%]，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。Glut1表達與病理類型、TNM分期、淋巴結轉移有關（P < 0.05）。VEGF表達與TNM分期、淋巴結轉移有關（P < 0.05）。PCNA表達與淋巴結轉移有關（P < 0.05）。Glut1與VEGF表達呈正相關（r = 0.312，P < 0.01）。Glut1、VEGF的表達與PCNA均呈正相關（r = 0.306，P < 0.01；r = 0.415，P < 0.01）。 結論 Glut1、VEGF及PCNA與NSCLC的發生、發展密切相關，聯合檢測三者有助于判斷NSCLC的預后。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌；葡萄糖轉運蛋白1；血管內皮生長因子；增殖細胞核抗原

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（a）-0073-04

Expression and its correlation of Glut1， VEGF and PCNA in non-small cell lung cancer

ZHANG Xin1 WU Liping2 KANG Baojie1

1.Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261053， China； 2.Department of Respiratory Medicine， Weifang People's Hospital， Shandong Province， Weifang 261041， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and its correlation of glucose transporter 1 （Glut1）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods The samples in this study were obtained from 113 cases of patients taking chest surgery hospitalized in Weifang People's Hospital from August 2013 to June 2015， among whom， 93 cases of NSCLC tissues were taken as experimental group and 20 cases of benign lesion lung tissues were taken as control group. Expression of Glut1， VEGF and PCNA in NSCLC tissues and benign lesion lung tissues was detected by immunohistochemistry， and the relationship of their expression with the clinical pathological parameters of NSCLC and their correlation were analyzed. Results The positive rate of Glut1， VEGF and PCNA labeling index （PCNA-LI） in the experimental group was 89.25% （83/93）， 80.65% （75/93） and （67.65±26.11）% respectively， which were higher than those of control group [15.00% （3/20）， 25.00% （5/20） and （25.25±9.34）%]， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of Glut1 was correlated with pathological types， TNM stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. The expression of VEGF was correlated with TNM stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. The expression of PCNA was correlated with lymph node metastasis （P < 0.05）. There was a positive correlation between Glut1 and VEGF expression （r = 0.312， P < 0.01）， and the expressions of Glut1， VEGF with PCNA both showed positive correlation （r = 0.306， P < 0.01； r = 0.415， P < 0.01）. Conclusion The positive expressions of Glut1， VEGF and PCNA in NSCLC may play an important role in the occurrence and development of NSCLC. Combined detection of the three indicators will help to estimate the prognosis of NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer； Glucose transporter1； Vascular endothelial growth factor； Proliferating cell nuclear antigen

肺癌發病率及死亡率均居全球惡性腫瘤首位，盡管診斷、手術、放化療等已取得一定成效，但肺癌尤其是非小細胞肺癌（NSCLC）的治療效果及預后較差，而惡性腫瘤治療失敗的重要原因為侵襲和轉移。葡萄糖轉運蛋白1（Glut1）為葡萄糖跨膜轉運的主要載體，對細胞能量代謝起著關鍵性作用。血管內皮生長因子（VEGF）為惡性腫瘤血管生成中重要的調節因子。它在腫瘤的生長、侵襲和轉移過程中起關鍵作用，是近年的研究熱點[1]。增殖細胞核抗原（PCNA）是DNA多聚酶σ的輔助蛋白，其合成與DNA復制和細胞增殖直接相關[2]。本研究應用免疫組織化學染色法檢測NSCLC組織中Glut1、VEGF和PCNA蛋白的表達水平，探討三者在NSCLC發生、發展中的作用及其相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取濰坊醫學院附屬濰坊市人民醫院（以下簡稱“我院”）胸外科2013年8月～2015年6月行肺段葉切除手術的原發性NSCLC患者93例的組織標本作為實驗組，所有患者在接受手術之前均未行放療、化療等相關治療。實驗組中男54例，女39例；年齡35～76歲，平均（58.84±8.02）歲；組織類型：肺鱗癌32例，肺腺癌61例；按1997年UICC修訂的標準[3]進行TNM分期：Ⅰ期49例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅳ期7例；組織學分化程度：高分化29例，中分化42例，低分化22例；有淋巴結轉移者46例，無淋巴結轉移者47例；有吸煙史42例，無吸煙史51例。對照組選取我院同期肺良性病變組織20例，其中包括11例炎性病變，5例肺大皰，4例肺結核。實驗中采用的NSCLC及良性病變組織標本均經病理切片證實。本研究所入選的患者均已知情同意并簽署知情同意書，醫院倫理委員會均通過。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人Glut1多克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體購自北京中杉金橋生物有限公司。所有標本均由中性甲醛固定，采用免疫組化SP法、石蠟包埋組織經切片，微波行抗原修復，其余均按照試劑盒說明嚴格執行，采用PBS液代替一抗來作為陰性對照，用已知陽性的癌組織作陽性對照。

1.3 評定標準

參考Cooper等[4]報道的評判標準，將胞質和/或胞膜染為棕黃色的細胞定義為Glut1陽性細胞，在高倍鏡（×400）下隨機選擇5個視野，計算每張切片陽性細胞百分率，無癌細胞染色為陰性（-），<10%癌細胞染色為弱陽性（+），10%～50%癌細胞染色為中度陽性（++），>50%癌細胞染色為強陽性（+++）。VEGF參考Ye等[5]報道的判斷標準，胞質染為棕黃色即為VEGF陽性細胞，在400倍鏡下隨機選5個視野各計數200個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分率，標本中無癌細胞染色即為（-），1%～<25%癌細胞染色即為（+），25%～50%癌細胞染色即為（++），>50%癌細胞染色即為（+++）。將細胞核內出現棕黃色顆粒定義為PCNA陽性細胞，每張切片觀察5個高倍（400×）視野，各計數100個腫瘤細胞，計算PCNA陽性細胞百分率，將其定義為PCNA標記指數（PCNA-LI）；其中陽性細胞所占百分比<50%定義為低表達，≥50%定義為高表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件，其中計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，采用Pearson等級相關分析進行相關性檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Glut1、VEGF和PCNA在NSCLC組織中的表達

實驗組中Glut1、VEGF陽性率及PCNA-LI分別為89.25%（83/93）、80.65%（75/93）和（67.65±26.11）%，均高于對照組[15.00%（3/20）、25.00%（5/20）和（25.25±9.34）%]，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）（圖1～3）。

2.2 Glut1、VEGF和PCNA與臨床病理因素間的關系

Glut1在NSCLC組織中的表達與TNM分期、淋巴結轉移及病理類型有關（P < 0.05），而與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、吸煙無關（P > 0.05）。VEGF表達與TNM分期、淋巴結轉移有關（P < 0.05），而在不同年齡、性別、組織分化程度、腫瘤病理類型及是否有吸煙史方面差異無統計學意義（P > 0.05）。淋巴結轉移者PCNA的陽性表達率高于無淋巴結轉移者（P < 0.05），而與其他因素無關。見表1。

2.3 Glut 1、VEGF、PCNA表達的相關性

NSCLC組織中，通過Pearson等級相關分析，Glut1與VEGF表達呈正相關（r = 0.312，P < 0.01）。見表2。Glut1、VEGF的表達與PCNA 均呈正相關（r = 0.306，P < 0.01；r = 0.415，P < 0.01）。見表3。

3 討論

惡性腫瘤細胞主要特點是增殖迅速，其耗氧量不斷增加導致供能和耗能之間不平衡，因此細胞對氧和營養的過度消耗導致腫瘤低氧、低糖的微環境，為適應此微環境，通過增加葡萄糖攝取來獲取能量，Glut1是葡萄糖跨膜轉運最重要的載體，它同惡性腫瘤的進展有直接的相關性。本研究結果顯示，實驗組中Glut1的陽性表達率顯著高于對照組，且淋巴結轉移者中Glut1的陽性表達明顯高于無轉移者，中晚期的表達高于早期者，這與Noguchi等[6]實驗結果相符。另外一些研究也發現，Glut1同惡性腫瘤的TNM分期以及淋巴結轉移有關，因此可用于判斷惡性腫瘤的預后[7]。在NSCLC組織中，鱗癌Glut1的陽性表達明顯高于腺癌，且鱗癌在腫瘤的癌巢中央染色較深。這與Meijer等[8]研究的結果相符，其研究表明，鱗癌相較于腺癌能更多地表達Glut1，這可能同鱗癌多以巢狀生長有關，其中央的血供較差，為滿足其快速增殖的能量供應，繼發葡萄糖轉運增多，其與病理類型的相關性機制尚需進一步研究。Glut1對肺癌攝取葡萄糖起著重要作用，而正常組織及腫瘤組織對葡萄糖的攝取存在差異，由此推斷高表達Glut1可能是腫瘤早期診斷和惡化進展的重要指標，并提示腫瘤具有侵襲性和不良的預后。

實體腫瘤生長和轉移的前提是血管生長，它在實體腫瘤的發生、發展中起重要的作用[9]。肺癌相較于其他惡性腫瘤更易發生遠處轉移，其可能的原因是肺組織毛細血管比其他的組織更為豐富[10]。VEGF是最主要的血管生長促進因子之一，可促使新生血管的生長和延伸，從而促進腫瘤的生長與轉移。本研究結果顯示，VEGF在實驗組中的陽性表達率明顯高于對照組，另外還發現，有淋巴結轉移的VEGF陽性表達率高于無淋巴結轉移者，中晚期的VEGF陽性表達率高于早期者（P < 0.05）。因此可推測VEGF在肺癌的發生、發展過程中起到了關鍵作用，并且同肺癌的惡性程度有關，提示該因子有可能作為評估肺癌患者預后的指標。

PCNA是細胞增殖合成DNA所必需的核蛋白，與DNA的復制以及細胞增殖密切相關[11]，檢測它在細胞中的表達，可作為評價細胞增殖狀態的一個指標。本研究結果顯示，實驗組PCNA的表達高于對照組，且有淋巴結轉移者表達高于無轉移者（P < 0.05），提示高表達PCNA與肺癌發生及生物學行為有關，同時可作為判斷肺癌預后的重要指標。

腫瘤的發生、發展是一個多基因調控和多步驟發展的過程。本研究發現，NSCLC組織中，Glut1、VEGF和PCNA均為高表達，且Glut1與VEGF的表達呈正相關，可能是因為惡性腫瘤的快速增殖導致其血液供應不能滿足能量需求，促使腫瘤釋放出特異性血管形成因子（如VEGF），因而促進了GLUT1的高表達。VEGF、Glut1的表達均與PCNA呈正相關，推測Glut1及VEGF高表達可能跟NSCLC增殖活動有關，但是對于它們促進腫瘤細胞增殖的具體機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。

Glut1、VEGF及PCNA在NSCLC的發生、發展過程中起重要作用，三者聯合檢測可作為評價NSCLC生物學行為及其預后的重要生物學指標，為其早期診斷及預防提供重要參考依據，具有一定的臨床應用價值。

[參考文獻]

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[5] Ye X，Lu D. HER-2 and VEGF expression in breast cancer and their correlations [J]. Chinese-German J Clin Oncol，2010，9（4）：208-212.

[6] Noguchi Y，Saito A，Miyagi Y，et al. Suppression of facilitative glucose transporter 1 mRNA can suppress tumor growth [J]. Cancer Lett，2000，154（2）：175-182.

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[8] Meijer TW，Schuurbiers OC，Kaanders JH，et al. Differences in metabolism between adeno-and squamous cell non-small cell lung carcinomas：spatial distribution and prognostic value of GLUT1 and MCT4 [J]. Lung Cancer，2012， 76（3）：316-323.

[9] Shang L，Zhao J，Wang W，et al. Inhibitory effect of endostar on lymphangiogenesis in non-small cell lung cancer and its effect on circulating tumor cells [J]. Chinese Journal of Lung Cancer，2014，20（10）：722-729.

[10] 錢玥，鄒萍.血管內皮生長因子在非小細胞肺癌患者診斷中的應用價值[J].當代醫學，2014，20（12）：8-9.

[11] Dieckman LM，Freudenthal BD，Washington MT. PCNA structure and function：insights from structures of PCNA complexes and post-translationally modified PCNA [J]. Subcell Biochem，2012，62（3）：281-299.

（收稿日期：2015-10-22 本文編輯：張瑜杰）