Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件信號通路對腦損傷大鼠的神經(jīng)保護作用及機制

薛毅輝 陳富勇 吳贊藝 王燈亮 葛洪良

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 福州 350005)

?

Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件信號通路對腦損傷大鼠的神經(jīng)保護作用及機制

薛毅輝 陳富勇1吳贊藝 王燈亮 葛洪良

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 福州 350005)

目的 研究Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路對腦損傷大鼠的神經(jīng)保護作用及機制。方法 將60只SD大鼠隨機分為2組，其中假手術(shù)組4只，模型組56只。模型組分為A組和B組：A組于手術(shù)前24 h腹腔注射特丁基對苯二酚(tBHO)50 mg/kg(5 mg/ml)，B組注射等量生理鹽水。比較假手術(shù)組和模型組術(shù)后神經(jīng)行為評分、腦組織含水量和神經(jīng)細胞凋亡率。比較A組和B組不同時刻(術(shù)后1、3、6、12、24 h，3、7 d)的單核細胞血紅素氧合酶(HO)-1、醌氧化還原酶(NQO)1、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平。結(jié)果 各組神經(jīng)行為評分，腦組織含水量，凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組術(shù)后不同時刻的HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Nrf2-ARE通路主要通過上調(diào)下游抗氧化酶的表達發(fā)揮對腦損傷大鼠神經(jīng)保護作用。

Nrf2-ARE通路；腦損傷；氧化應(yīng)激反應(yīng)；抗氧化酶

顱腦損傷的病理生理過程包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷，其特點是腦皮質(zhì)及白質(zhì)搓碎、破裂，出血、水腫，血管栓塞，部分神經(jīng)細胞壞死；后者包括一系列的損傷級聯(lián)反應(yīng)，主要包括氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)細胞凋亡等，其中氧化應(yīng)激是繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制〔1〕。針對顱腦損傷的復(fù)雜病理生理機制，臨床上尚未出現(xiàn)有效的干預(yù)措施，故患者預(yù)后較差。目前，Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路在腦損傷中的作用引起了較為廣泛的關(guān)注〔2〕，本次研究旨在探討Nrf2-ARE信號通路對腦損傷大鼠的神經(jīng)保護作用及機制。

1 資料與方法

1.1 動物、主要儀器及試劑 SD大鼠60只，體重為200～220 g，平均(210.0±6.2)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號14-0212。主要儀器及試劑為Elx800光吸收酶標儀〔美國伯騰(北京)儀器有限公司〕、改良液壓沖擊裝置(中國天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)、BX53電子顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、Image-Pro Insight 圖像分析軟件(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)、Gallios流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)、特丁基對苯二酚(tBHQ，上海棋成實業(yè)有限公司)、細胞凋亡測試盒(UNNEL法，上海博耀生物科技有限公司)、抗Nrf2抗體和抗β-actin抗體〔艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司〕、大鼠單核細胞血紅素氧合酶(HO)-1單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)、大鼠醌氧化還原酶(NQO)1單克隆抗體(上海古朵生物科技有限公司)、大鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA分析檢測試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(上海研拓生物科技有限公司)、羊抗鼠多克隆抗體(北京中杉金橋公司)、蛋白定量檢測試劑盒(美國Pierce公司)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(瑞典CE life science公司)。

1.2 實驗動物分組及模型構(gòu)建 對大鼠進行分組，其中假手術(shù)組4只，模型組56只。均進行適應(yīng)性培養(yǎng)1 w。大鼠實驗前禁食12 h：模型組根據(jù)隨機數(shù)字表法分為A組，術(shù)前24 h給予腹腔注射Nrf2激動劑tBHQ，每隔8 h給藥1次(5 mg/ml)，每次劑量為16.7 mg/kg，共3次，總計50 mg/kg；B組同時給予等量生理鹽水。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔麻醉后，在無菌條件下沿頭部正中矢狀位切開皮膚、皮下組織，剝離顱骨外膜，在距離矢狀縫、冠狀縫5 mm處用磨鉆鉆取直徑0.5 cm的小孔，保持硬腦膜完整，使用改良液壓沖擊裝置造模，壓力為0.2 MPa。假手術(shù)組常規(guī)麻醉、開顱，但不行液壓沖擊。觀察大鼠恢復(fù)自主呼吸即放回飼養(yǎng)籠，進行損傷后觀察〔3〕。 分別將A組4只大鼠和B組4只大鼠于相應(yīng)時間點處死，取材對腦挫傷灶及其周圍區(qū)進行組織學(xué)觀察。

1.3 大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分 術(shù)后24 h進行大鼠腦損傷神經(jīng)功能評分，采用雙盲法〔4〕。

1.4 腦組織含水量測定 術(shù)后24 h用濾紙吸除標本表面水分，分析天平稱濕重后于110℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥24 h至 恒重，稱干重后按Elliot公式〔腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%〕計算腦含水量〔5〕。

1.5 組織學(xué)觀察 ①神經(jīng)細胞凋亡率：術(shù)后24 h取腦組織進行組織染色的標本用4%多聚甲醛固定并進行組織學(xué)檢查。對組織進行轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(TUNEL)染色并在顯微鏡下(×400)觀察凋亡細胞(細胞核出現(xiàn)棕黃染顆粒)，在鏡下分5個視野計數(shù)細胞并計算凋亡率。凋亡率=(凋亡細胞/總細胞數(shù))×100.00%。②大鼠Nrf2表達水平檢測：手術(shù)后1、6、12、24 h，3、7 d采用Western印跡檢測大鼠Nrf2表達水平。取新鮮腦組織裂解、勻漿后取上清液，蛋白定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和膜封閉，封閉結(jié)束后分別滴加Nrf2大鼠單抗4℃孵育過夜。加入二抗室溫下于搖床孵1 h，二抗孵育后顯色、曝光、顯影。測量并分析上述蛋白的光密度值，并以β-actin為內(nèi)參計算相對光密度值(ROD)。③大鼠抗氧化與氧化物質(zhì)水平的檢測：別于手術(shù)后1、6、12、24 h，3、7 d檢測大鼠HO-1，NQO1，GSH和ROS水平。HO-1和NQO1采用Western印跡法，方法同②。 GSH采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，ROS檢測采用流式細胞法，操作嚴格按照說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及腦組織含水量 各組神經(jīng)行為學(xué)評分和腦組織含水量差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠神經(jīng)細胞凋亡率比較 假手術(shù)組神經(jīng)細胞凋亡率(1.17±0.23)%，A組(23.98±4.17)%，B組(47.65±8.96)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.984，P<0.05)。

2.3 大鼠不同時點的Nrf2表達水平比較 A組和B組術(shù)后不同時點的Nrf2的ROD高于假手術(shù)組，A組和B組不同時刻的Nrf2ROD不同(P<0.05)。見表2。

2.4 大鼠不同時點HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平 各組術(shù)后不同時點HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平差異顯著(P<0.05)。見表3、表4。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評分及腦組織含水量比較±s,n=4)

與假手術(shù)組相比：1)P<0.05

表2 各組術(shù)后不同時點Nrf2 ROD水平比較

與A組比較：1)P<0.05

表3 各組術(shù)后不同時點HO-1和NQO1水平比較

表4 各組術(shù)后不同時點GSH和ROS水平比較

3 討 論

顱腦損傷的病理生理過程包括機械性沖擊造成的原發(fā)性損傷和損傷后啟動的一系列生化過程引起的繼發(fā)性、進行性神經(jīng)細胞損傷即繼發(fā)性腦損傷〔6〕。后者則一般持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天，是在首次損傷后啟動的包括一系列生化降解過程的損傷級聯(lián)反應(yīng)，主要包括興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡，由自由基造成的氧化損傷成為繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一〔7，8〕。為改善顱腦損傷者的預(yù)后，臨床上除避免或減輕原發(fā)性腦損傷外，還應(yīng)該對繼發(fā)性腦損傷進行干預(yù)。

顱腦損傷大鼠存在氧化應(yīng)激、鈣紊亂、線粒體毒性、炎癥和凋亡等一系列病理生理變化：同時，大鼠體內(nèi)存在抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)〔9〕。Nrf2反應(yīng)性表達增加，引起下游ARE元件及包含的HO-1和NQO1等抗氧化酶的表達水平增高，從而發(fā)揮抗氧化作用。大鼠術(shù)后的GSH水平明顯降低，而ROS水平增加，說明抗氧化能力減弱。Nrf2是具有基本亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下存在于胞質(zhì)內(nèi)，一種Keap1蛋白可以特異結(jié)合在Nrf2的氨基端，使Nrf2的活性受到抑制。當誘導(dǎo)劑存在的情況下，Nrf2磷酸化，向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。磷酸化的Nrf2進入核內(nèi)后，通過P38/ERK/JNK途徑與Maf蛋白形成異二聚體，并與ARE結(jié)合〔10〕。ARE是順式作用元件的一段增強子序列，NQO1、HO-1等基因序列中都存在ARE序列。因此，ARE介導(dǎo)細胞內(nèi)參與氧化應(yīng)激的基因轉(zhuǎn)錄水平的激活，Nrf2-ARE信號的激活能夠上調(diào)多種抗氧化酶、解毒酶的表達，抑制炎性反應(yīng)，強力升高細胞保護功能〔11〕。本研究說明Nrf2-ARE通路對腦損傷大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，而tBHQ的可以通過上調(diào)Nrf2表達減輕大鼠的腦水腫和神經(jīng)細胞凋亡〔12〕。

1 錢 偉，錢志遠，沈合春，等.大鼠原發(fā)腦挫傷灶和鄰近腦組織在繼發(fā)性腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(2)：299-300.

2 Andriessen TM，Jacobs B，Vos PE.Clinical characteristics and pathophysiological mechanisms of focal and diffuse traumatic brain injury〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(10)：2381-92.

3 陳梅花，陳貴珍，賈萬鈞，等.改良大鼠彌漫性腦損傷實驗?zāi)Ｐ汀睯〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013;23(7)：29-31.

4 孫國柱，楊連琦，陳盼虎，等.不同沖擊壓力腦損傷大鼠神經(jīng)功能評分差異性與病理學(xué)特征的關(guān)系〔J〕.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2012;21(8)：687-9.

5 何 婭，陳松盛，王 輝，等.EPO對大鼠腦缺血再灌注后腦水腫及MMP-9的影響〔J〕.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012;43(7)：481-4，561.

6 Bor-Seng-Shu E，de Lima Oliveira M，Teixeira MJ.Traumatic brain injury and metabolism〔J〕.J Neurosurg,2010；112(6)：1351-3.

7 Chamoun R，Suki D，Gopinath SP，etal.Role of extracellular glutamate measured by cerebral microdialysis in severe traumatic brain injury〔J〕.J Neurosurg，2010;113(3)：564-70.

8 趙柏雄，田衍平，蔡其燕，等.新生大鼠慢性腦缺血損傷中氯離子通道ClC2的表達及其與白質(zhì)發(fā)育影響作用的研究〔J〕.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2015；24(1)：1-8.

9 Bartnik-Olson BL,Oyoyo U，Hovda DA，etal.Astrocyte oxidative metabolism and metabolite trafficking after fluid percussion brain injury in adult rats〔J〕.J Neurotrauma，2010；27(12)：2191-202.

10 鄭海燕，洪 遠，陳 高，等.Nrf2-ARE在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中的表達及意義〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志，2013；29(1)：80-4.

11 吳 丹.HO-1調(diào)控Nrf2-ARE信號通路對腦出血后神經(jīng)保護作用的實驗研究〔D〕.南昌：南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2014.

12 林 正，曾 博，尹 康，等.Nrf2-ARE信號通路在外傷性腦損傷神經(jīng)保護作用的機制研究〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013；51(11)：11-3.

〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省屬高校科研專項項目(No.JK2012021)

薛毅輝(1962-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事顱腦損傷和顱底中線腫瘤研究。

R285.6

A

1005-9202(2016)20-4953-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.006

1 深圳市第二人民醫(yī)院功能神經(jīng)科