異丙酚對(duì)大鼠抑郁模型電休克治療后認(rèn)知功能和海馬Glu濃度及Tau蛋白磷酸化程度的影響

姚柱煒 蒙劍鋒 欒宏權(quán)

廣東深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科 深圳 518111

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·論著·

異丙酚對(duì)大鼠抑郁模型電休克治療后認(rèn)知功能和海馬Glu濃度及Tau蛋白磷酸化程度的影響

姚柱煒 蒙劍鋒△欒宏權(quán)

廣東深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科 深圳 518111

目的 探討異丙酚對(duì)電休克治療后抑郁大鼠認(rèn)知功能及海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化的影響。方法 選擇雌性SD(Sprague Dawley)大鼠建立大鼠抑郁模型，利用曠場(chǎng)試驗(yàn)選擇得分30～80分大鼠20只，隨機(jī)分為4組(n=5)：A組注射生理鹽水，B組給予異丙酚，C組給予電休克治療，D組給予電休克和異丙酚注射聯(lián)合處理，E組正常小鼠，注射生理鹽水。處理后3 d進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)，記錄逃避潛伏期(s)、經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)、原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)。隨后檢測(cè)海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度。結(jié)果 與A組相比較，C組逃避潛伏期(s)延長(zhǎng)、經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)、原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)減少，海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度增高(P<0.05)；與C組相比，D組逃避潛伏期(s)縮短，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)、原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)增加，海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度減低(P<0.05)。結(jié)論 ECT通過(guò)增高Glu濃度促進(jìn)Tau蛋白磷酸化，影響抑郁大鼠認(rèn)知功能，而異丙酚可以調(diào)節(jié)ECT引起的Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度，進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能。

異丙酚；電休克療法；認(rèn)知功能；谷氨酸；Tau蛋白

神經(jīng)外科手術(shù)后導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙仍困擾著廣大臨床醫(yī)生。術(shù)后抑郁癥主要影響患者的海馬結(jié)構(gòu)。對(duì)于一些精神障礙患者，電休克療法(electroconvulsive therapy，ECT)是有效的軀體干預(yù)治療方式，但同時(shí)也可導(dǎo)致神經(jīng)心理功能障礙等不良反應(yīng)。目前我們已知Tau 蛋白和Glu都是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)受自身磷酸化程度和突觸間隙劑量影響[1-2]。ECT治療后的患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙機(jī)制有多種，其中包括誘導(dǎo)Glu過(guò)度釋放，誘導(dǎo)Glu依賴(lài)的LTP過(guò)程[3]，而N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)拮抗劑則可以避免ECT引起的LTP抑制作用，阻斷Glu大量釋放造成的GluR過(guò)度興奮[2，4]。在此我們通過(guò)構(gòu)建抑郁后ECT大鼠模型，檢測(cè)大鼠海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度，探討異丙酚是否通過(guò)影響Glu濃度調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化程度，并用水迷宮評(píng)價(jià)是否影響大鼠認(rèn)知功能。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 Harvard嚙齒類(lèi)動(dòng)物ECT儀，上海移數(shù)信息科技有限公司的Morris水迷宮(中國(guó))，AstraZeneca公司的異丙酚(意大利)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB：14925-2001)雌性SD(Sprague Dawley)大鼠，鼠齡24周，體質(zhì)量(275±25)g。

1．2 方法

1．2．1 制作大鼠抑郁模型：將大鼠各自單獨(dú)飼養(yǎng)于一籠，用輕度慢性不可刺激構(gòu)建大鼠抑郁模型。以1次/s的頻率在水平方向搖晃鼠籠，共15 min；持續(xù)1 d將鼠籠傾斜45°；用夾子夾鼠尾1 min；1 d內(nèi)不予飲水、進(jìn)食；在45 ℃熱水中、4 ℃冰水中游泳5 min；1 d內(nèi)將大鼠處于白天無(wú)光、夜間燈照環(huán)境使其晝夜顛倒；予1 d潮濕墊料，每天給予不同刺激，相鄰兩天不用同種刺激，共28 d。適應(yīng)性培養(yǎng)1周后在20：00點(diǎn)進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)，大鼠在曠箱內(nèi)四肢全落在1個(gè)格子里視為水平活動(dòng)1次，反映其活動(dòng)度，為水平計(jì)分，兩爪騰空或爬在箱壁上視為豎直活動(dòng)1次，反映大鼠好奇程度，為豎直計(jì)分。2次/周，共1周。2次結(jié)果取平均值，選水平得分和垂直得分的總分30～80分的大鼠20只[5]。

1．2．2 動(dòng)物分組：利用隨機(jī)分組方法將模型動(dòng)物分成4組，A組予生理鹽水經(jīng)腹腔注射，B組予異丙酚經(jīng)腹腔注射，C組進(jìn)行電休克處理，D組予異丙酚經(jīng)腹腔注射后行電休克治療，E組為正常大鼠作對(duì)照并注射生理鹽水。B、D組注射異丙酚80 mg/kg，A、C、E組均予等體積生理鹽水。先行腹腔藥物注射后行ECT，在C、D組大鼠雙耳上夾休克儀電極(正弦波，50 mA，50 Hz)，通電1 s誘使大鼠出現(xiàn)強(qiáng)直-陣攣抽搐發(fā)作，A、B、E組大鼠雙耳夾電極但不通電。各組處理均1次/d，7 d，于15：00～17：00進(jìn)行。

1．2．3 水迷宮試驗(yàn)：利用Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)大鼠認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。圓柱形恒溫水池作為水迷宮，將水池分為4個(gè)象限，以方向?yàn)樽鴺?biāo)(NE、SE、NW和SW)，NE象限中央水面下1 cm放置平臺(tái)。池壁池水均為黑色，水溫24～25 ℃，室內(nèi)避光、安靜，各物品擺放位置固定。定位航行試驗(yàn)，共6 d，每天在固定時(shí)間段行4次試驗(yàn)。背向池壁將大鼠隨機(jī)從各個(gè)象限放入水池，2 min內(nèi)記錄大鼠尋到平臺(tái)的時(shí)間，若2 min后大鼠仍未尋到平臺(tái)則引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)，并記為120 s，此即為水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期(s)、原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)，同時(shí)記錄經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)。將后3 d結(jié)果取平均值用于大鼠記憶功能的評(píng)估。每次實(shí)驗(yàn)完后擦干大鼠并休息3 min，隨后進(jìn)行第2次實(shí)驗(yàn)。空間探索實(shí)驗(yàn)第7天撤去平臺(tái)，背向池壁從距離平臺(tái)最遠(yuǎn)處將大鼠放入水中，1 min內(nèi)記錄大鼠逃避潛伏期(s)、原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)、經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)。

1．2．4 大鼠海馬取材：水迷宮試驗(yàn)完成后，經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥使大鼠麻醉，并迅速斷頭取出雙側(cè)海馬組織，右側(cè)海馬組織固定于10%多聚甲醛中，左側(cè)海馬組織先稱(chēng)質(zhì)量，隨后將1 mL甲醇-水離心液加入，在低溫下攪拌并獲得勻漿，控制溫度在4 ℃時(shí)取部分勻漿液以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，離心后分離獲取上清，并行進(jìn)一步過(guò)濾后在-80 ℃低溫下保存。以μg·g-1作為單位計(jì)算組織中的含量。

1．2．4．1 海馬Glu濃度測(cè)定：儀器及試劑：Eppendof公司的centrifuge5810R低溫高速離心機(jī)，Waters公司的HPLC色譜系統(tǒng)；Dima公司的C18-ODS色譜柱。流動(dòng)相A、B分別為0.1 mol/L醋酸鉀及甲醇。采用二元梯度洗脫方法，洗脫步驟為：(T，B%)(0，45%)(1，65%)(6，75%)(20，45%)，其中T代表時(shí)間(單位：min)，B%代表B流動(dòng)相占總洗脫過(guò)程百分比。利用孔徑為0.45 μm的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾流動(dòng)相，隨后用超聲脫氣。流速為1.0 mL/min，所激發(fā)的波長(zhǎng)為250 nm，發(fā)射的波長(zhǎng)為410 nm，并根據(jù)Glu峰面積進(jìn)行定量估算。制備標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)溶液為100 μmol·L-1，采用Glu標(biāo)準(zhǔn)品制備而成，并在稀釋后測(cè)定。制備衍生化試劑：將20 mg OPA加至500 μL甲醇中并在超聲作用下溶解，隨后將500 μL β-巰基乙醇加入，最后再加入pH 10．0的硼酸緩沖液9 mL，避光并密封，保存溫度在0～4 ℃。衍生及分析：將100 μL標(biāo)準(zhǔn)液和100 μL衍生化試劑加至EP管中予2 min反應(yīng)時(shí)間，隨后進(jìn)樣20 μL。

1．2．4．2 海馬Tau蛋白磷酸化程度測(cè)：通過(guò)免疫組化方法測(cè)定右側(cè)海馬組織中Tau蛋白磷酸化程度。行脫水透明、浸蠟包埋、切片(4 μm)、二甲苯脫蠟后用抗ptau-Ser202多克隆抗體，抗ptau-Ser396單克隆抗體(1：200)進(jìn)行免疫組化染色，任意選擇3張切片，在每張切片選擇CA1區(qū)、CA2區(qū)的隨機(jī)5個(gè)視野，用Image-Pro plus 6.0軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值，去除各區(qū)5個(gè)視野中的最大值、最小值，計(jì)算剩余數(shù)的平均值，通過(guò)均值評(píng)價(jià)Tau-Ser202、Tau-Ser396磷酸化水平。

2 結(jié)果

2．1 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能改變 處理后各組大鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。相較于A組，C、D組逃避潛伏期(s)延長(zhǎng)，原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)及經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)減少(P<0.05)；相較于C組，D組逃避潛伏期(s)縮短，原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間(s)及經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)(次)增多(P<0.05)。

表1 各組Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

2．2 海馬Glu濃度測(cè)定 A組Glu濃度51±11.2，B組為63±9.5，C組為170±21.4，D組為94±17.8，F(xiàn)組為72.6，C、D組海馬內(nèi)Glu濃度較A組高(P<0.05)；而D組海馬內(nèi)Glu濃度又較C組低(P<0.05)。

2．3 海馬Tau蛋白磷酸化程度改變 與A組相比，用ECT處理后的C組Tau蛋白磷酸化(ptau-ser202、ptau-ser396)水平升高(P<0.05)；與C組相比，D組Tau蛋白磷酸化(ptau-ser202、ptau-ser396)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 海馬Tau蛋白磷酸化程度，平均吸光度值)

3 討論

Tau 蛋白是Weingarlen等[6]于1975年發(fā)現(xiàn)的在微管組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用的糖蛋白，同時(shí)也是重要的記憶相關(guān)蛋白。目前大量研究表明，Tau蛋白過(guò)度磷酸化可導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電，使得微管組裝過(guò)程受阻，引起微管破壞、神經(jīng)毒性等，亦是阿爾茲海默病的早期事件[7]。Glu作為一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其過(guò)度活化能引起胞內(nèi)Ca2+超載，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡[8]，此外，尚能使多種蛋白激酶的活性受抑制，如Akt，而Akt通過(guò)一系列信號(hào)通路又能參與Tau蛋白磷酸化程度的調(diào)控[9]。ECT治療術(shù)后引起的認(rèn)知功能障礙仍是目前神經(jīng)外科術(shù)后值得關(guān)注的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)中C組Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度與A組相比明顯升高，認(rèn)知功能也明顯降低。因此，我們認(rèn)為，ECT等應(yīng)激可引起Glu過(guò)度活化，一方面，其興奮性毒性經(jīng)一系列信號(hào)過(guò)程直接損傷神經(jīng)元；另一方面，通過(guò)促進(jìn)Tau蛋白磷酸化也可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進(jìn)而影響到機(jī)體認(rèn)知功能。

Vossel等[10]發(fā)現(xiàn)，過(guò)度激活NMDAR可通過(guò)活化GSK-3β、酪蛋白激酶2等增加Tau磷酸化程度，從而導(dǎo)致神經(jīng)元受損。而NMDAR拮抗劑可與GluR結(jié)合進(jìn)而減輕Glu與其受體結(jié)合引起的過(guò)度興奮性反應(yīng)，有研究表明NMDAR拮抗劑可顯著抑制冷水應(yīng)激引起的磷酸化Tau蛋白水平升高[11-12]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與A組大鼠相比，C組海馬出現(xiàn)Glu濃度增高，Tau蛋白磷酸化程度明顯增高(P<0.05)，而與C組相比，D組Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度又有明顯降低(P<0.05)。提示異丙酚作為NMDAR拮抗劑一種，可降低ECT引起的海馬Glu濃度增高，進(jìn)而下調(diào)Tau蛋白磷酸化水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)認(rèn)知功能的改善。但Veaelis等[13]研究表明，異丙酚本身對(duì)病人的認(rèn)知功能亦有一定損傷，陳靜等[14]實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠下調(diào)海馬神經(jīng)元內(nèi)NF-κB活性及增加胞內(nèi)Ca2+濃度，進(jìn)而引起神經(jīng)元損傷。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與A組相比，B組認(rèn)知功能并未得到明顯改善，同時(shí)Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度也未明顯下降，提示異丙酚本身并不會(huì)改善大鼠認(rèn)知功能，這點(diǎn)在黎平等[15]和Dong等[16]實(shí)驗(yàn)中亦有證實(shí)。因此，ECT通過(guò)增高Glu濃度促進(jìn)Tau蛋白磷酸化，進(jìn)而影響抑郁大鼠認(rèn)知功能，而異丙酚可以調(diào)節(jié)ECT后引起的Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度，進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能。

本研究選擇輕微慢性不可逆刺激構(gòu)建大鼠抑郁模型，一方面可以避免嗅球切除模型中可能出現(xiàn)的手術(shù)應(yīng)激和其余腦組織損傷；另一方面，耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。利用曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)建模是否成功，Morris水迷宮試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能，選擇逃避潛伏期、經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)、原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，是大鼠模型中常用的試驗(yàn)。

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(收稿2015-10-02)

The impact of propofol on cognitive function and Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in depressed rats after electroconvulsive therapy

YaoZhuwei，MengJiangfeng，LuanHongquan

DepartmentofNeurosurgery，LonggangDistrictFifthPeople'sHospitalofShenzhen，Shenzhen518000，China

Objective To discuss the impact of propofol on cognitive function，Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in depressed rats after electroconvulsive therapy. Methods Female Sprague Dawley (SD) rats were selected to establish depression model and field test was used to select 20 rats，with scores 30 to 80.These SD rats were divided them into four groups randomly (n=5)：A group injected with saline；B group injected with propofol；C group treated with ECT；D group treated with ECT and propofol；E group selected normal rats in contrast and injected with saline. Three days after treatment，Morris water maze test was used to record escape latency(s)，the number of passing by the original platform position，the residence time of the original platform quadrant(s)，then Glu concentration and extent of Tau phosphorylation were also determined by relevant experiments. Results Compared to A group，the escape latency(s) prolonged，the number of passing by the original platform position，the residence time of the original platform quadrant(s) reduced，Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in hippocampus raised in C group (P<0.05)；compared to C group，the escape latency(s) reduced，the number of passing by the original platform position，the residence time of the original platform quadrant (s) raised，Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in hippocampus reduced in D group (P<0.05). Conclusion ECT can promote Tau phosphorylation through rising Glu concentration，and then influence cognitive function of depressed rats. Propofol can regulate Glu concentration and Tau phosphorylation that aroused by ECT，and then improve cognitive function of depressed rats.

Propofol；Electroconvulsive therapy；Cognitive function；Glu；Tau

深圳市科技計(jì)劃(JCYJ20150331095655740)

R-332

A

1673-5110(2016)19-0001-03

△通訊作者：蒙劍鋒，深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科，副主任醫(yī)師，Email：szmengjianfeng@sina.com