凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的關系

栗超躍 趙黎明△ 史錫文 裴兵兵 常運光 甘 強 杜文錦

1)河南省人民醫(yī)院神經外科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院 鄭州 450003

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凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的關系

栗超躍1)趙黎明1)△史錫文1)裴兵兵1)常運光1)甘 強1)杜文錦2)

1)河南省人民醫(yī)院神經外科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院 鄭州 450003

目的 觀察FⅦ基因多態(tài)性對FⅦa活性的影響，探討FⅦ基因多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的關系。方法 應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性或直接PCR方法檢測FⅦ多態(tài)性基因型。結果 凝血功能障礙和正常組FⅦ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性基因型和等位基因分布差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 FⅦ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性有關，F(xiàn)Ⅶ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷患者凝血功能障礙有關。

凝血因子Ⅶ；顱腦損傷；多態(tài)性；凝血功能障礙

凝血因子Ⅶ(FⅦ)是肝細胞分泌的一種自然狀態(tài)下以單肽鏈的酶原形式存在的維生素K依賴性單鏈絲氨酸蛋白酶，水解后可活化為雙肽鏈形式，且自身促凝活性增加。FⅦ是外源性凝血途徑的具有催化活性作用的一種酶，與組織因子結合啟動外源性凝血過程[1]。顱腦創(chuàng)傷引起腦內組織因子大量釋放以及血腦屏障的開放啟動了以FⅦ為核心的外源性凝血途徑[2]。研究報道[3]，血漿FⅦa活性下降是單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙的獨立危險因素。另有研究表明[4-6]，F(xiàn)Ⅶ基因-323P0/P10、R353Q、-401G/T、-402G/A、-670A/C和IVS7多態(tài)性與急性冠脈綜合征、心肌梗死以及腦卒中的易感性有關。有關FⅦ基因多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷患者血漿FⅦa活性及凝血功能障礙易感性的關系，國內外尚無相關報道。本研究旨在探討FⅦ基因多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的相關性，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 本研究以河南省人民醫(yī)院神經外科急救中心2012-03—2015-03住院的急性顱腦創(chuàng)傷患者為研究對象。納入標準：(1)年齡18～<70歲；(2)明確的頭部外傷史，單純中重型顱腦創(chuàng)傷患者(最佳GCS 5～12分，其他部位AIS≤3)，并經頭顱CT證實，發(fā)病24 h內入院；(3)受試者或其法定代表人簽署知情同意。排除標準：(1)外傷后預期壽命<24 h；(2)頭顱CT掃描時創(chuàng)傷發(fā)生時間不明或>24 h；(3)開放性顱腦損傷；(4)體質量>90 kg；(5)既往有腦部疾病(外傷性或非外傷性)伴永久神經缺陷者；(6)自身免疫性疾??；(7)急性或慢性感染性疾病。收集顱腦創(chuàng)傷患者877例，根據(jù)排除標準，最終240例納入研究范圍，其中凝血功能障礙108例，凝血功能正常132例。入組患者均在入院后24 h內采集空腹外周靜脈血10 mL，枸櫞酸鈉抗凝處理后放置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 主要材料與試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司，引物合成由上海生物工程有限公司完成，Vortex Genie 2渦旋振蕩器(上海迭戈生物科技有限公司)，PCR擴增儀(德國Biometrd公司)，Mini protean Ⅲ電泳儀與Bio-rad垂直電泳槽(北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司)。

1．3 PCR-RFLP方法檢測入組患者FⅦ基因型 引物合成和PCR反應體系設計參考文獻[1-2，7-9]，本研究選用濃度為2%的瓊脂糖凝膠，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段PCR擴增產物。FⅦ基因多態(tài)性目的片段經PCR擴增后，PCR產物需要進一步經限制性內切酶酶切鑒定。取經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增良好的PCR產物6 μL，加入對應的限制性內切酶配成酶切反應體系，在適宜溫度下恒溫孵育。最終將染色后的聚丙烯酰胺凝膠置于紫外檢測儀下觀察并用凝膠成像分析系統(tǒng)攝影。

2 結果

2．1 血漿FⅦa活性與FⅦ基因多態(tài)性的關系 血漿FⅦa高活性組與低活性組患者FⅦ基因多態(tài)性分析結果見表1。

表1 血漿FⅦa活性與FⅦ基因多態(tài)性的相關性

血漿FⅦa高活性組與低活性組患者-402G/A多態(tài)性基因型GG402、GA和AA的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，等位基因G和A的頻率分布也有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)Ⅶ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性有關。GG402基因型攜帶者血漿FⅦa活性相對高于AA基因型攜帶者，等位基因G402可能對維持血漿FⅦa處于較高水平有促進作用；而FⅦ基因-323P0/P10、R353Q、-670A/C和IVS7多態(tài)性基因型和等位基因的頻率分布與血漿FⅦa活性均無相關性。

2．2 凝血狀態(tài)與FⅦ基因多態(tài)性的關系 單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正?；颊吲cFⅦ基因多態(tài)性的相關性分析結果見表2。

表2 單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙與FⅦ基因多態(tài)性的相關性

單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正?；颊逨Ⅶ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性對應基因型GG402、GA、AA和H7H7、H7H6、H6H6的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，等位基因G402、A和H7、H6的頻率分布也有顯著性差異(P均<0.05)。FⅦ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性可能與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率有關。單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正?；颊逨Ⅶ基因-323P0/P10和-670A/C多態(tài)性基因型和等位基因的頻率分布與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率無相關性。

3 討論

FⅦ基因-402G/A[2]多態(tài)性屬于DNA單核苷酸多態(tài)性，是由于FⅦ基因402處鳥嘌呤核苷酸(G)被胸腺嘧啶核苷酸(T)置換。IVS7多態(tài)性則是指FⅦ基因第7內含子區(qū)域第4高變區(qū)(HVR4)中不同拷貝數(shù)的重復序列，也可稱為HVR4多態(tài)性，是一種DNA重復序列多態(tài)性，其重復序列為37 bp(5'-CTGGGTGGGTACCACTCTCCCCTGTCCGACCGCG GTG-3')，該基因多態(tài)性于1991年由Marchetti等首次報道。目前認為，-402G/A多態(tài)性影響血漿FⅦ水平的可能機制是由于啟動子區(qū)域該位點的1個等位基因的堿基發(fā)生顛換，改變了FⅦ基因正常序列。IVS7多態(tài)性是由于重復序列而影響FⅦ基因mRNA的剪接，影響mRNA的轉錄活性，從而使血漿FⅦa活性下降[9]。目前大多數(shù)研究認為，與H6H6多態(tài)性相比，H7H7多態(tài)性與血漿較低FⅦa活性相關[4，9]。

本研究結果顯示，盡管FⅦ基因-402位點G/A多態(tài)性基因型和IVS7位點H6H6基因型攜帶者血漿FⅦa活性最高，但分別與GG402、AA402和H7H7、H7H6基因攜帶者之間血漿FⅦa活性無顯著差異；但血漿FⅦa高活性組與低活性組患者及單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正常患者-402G/A多態(tài)性基因型GG402、GA和AA402的頻率分布差異均有統(tǒng)計學意義，提示FⅦ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性和單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率有關，GG402基因型攜帶者血漿FⅦa活性相對高于AA基因型攜帶者，而且GG402基因型攜帶者顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙的幾率也相對低于AA402基因型攜帶。因此認為，等位基因G402可能對維持血漿FⅦa處于較高活性有促進作用，同時提示等位基因G402可能對降低單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙具有積極作用，可能是單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的保護性基因。

IVS7僅僅在單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正?；颊呋蛐秃偷任换虻念l率分布存在顯著性差異，其中H6H6基因型攜帶者顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙的幾率相對低于H7H7基因型攜帶者，同時提示等位基因H6可能對降低單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙具有積極作用，可能是單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的保護性基因。

雖本研究結果表明FⅦ基因-402G和IVS7與血漿FⅦa水平和單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙有關，但同時也與既往研究結果存在差異，造成這種差異的原因可能是多方面的，但主要原因可能是研究對象和研究方法的差異。本研究只分析了單一位點多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能狀態(tài)的關系，而未聯(lián)合分析2個或多個位點多態(tài)性對單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能狀態(tài)的影響，故需進一步研究。

綜上所述，F(xiàn)Ⅶ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性有關，等位基因G402可能對維持FⅦa處于較高活性有促進作用；FⅦ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率有關，等位基因G402和H6可能對降低單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙具有積極作用，可能是單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的保護性基因。

[1] Pike AC，Brzozowski AM，Roberts SM，et al．Structure of human factor Ⅶa and its implications for the triggering of blood coagulation[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(16)：8 925-8 930．

[2] Hoffman M，Monroe DM．Tissue factor in brain is not saturated with factor Ⅶa：implications for factor Ⅶa dosing in intracerebral hemorrhage[J]．Stroke，2009，40(8)：2 882-2 884．

[3] 栗超躍，裴兵兵，吳惺，等．單純性顱腦創(chuàng)傷患者凝血因子Ⅶ活性與凝血功能障礙和進展性顱內出血性損傷的相關性分析[J]．中華醫(yī)學雜志，2014，94(9)：688-691．

[4] Iacoviello L，Di Castelnuovo A，De Knijff P，et al．Polymorphisms in the coagulation factor Ⅶ gene and the risk of myocardial infarction[J]．N Engl J Med，1998，338(2)：79-85．

[5] Taylor KC，Lange LA，Zabaneh D，et al．A gene-centric association scan for Coagulation Factor Ⅶ levels in European and African Americans：the Candidate Gene Association Resource(CARe)Consortium[J]．Hum Mol Genet，2011，20(17)：3 525-3 534．

[6] Maguire JM，Thakkinstian A，Sturm J，et al．Polymorphisms in platelet glycoprotein 1balpha and factor Ⅶ and risk of ischemic stroke：a meta-analysis[J]．Stroke，2008，39(6)：1 710-1 716．

[7] Ito K，Goto K，Sugiura T，et al．Polymorphisms of the factor Ⅶ gene associated with the low activities of vitamin K-dependent coagulation factors in one-month-old infants[J]．Tohoku J Exp Med，2007，211(1)：1-8．

[8] Carew JA，Basso F，Miller GJ，et al．A functional haplotype in the 5' flanking region of the factor Ⅶ gene is associated with an increased risk of coronary heart disease[J]．Thromb Haemost，2003，1(10)：2 179-2 185．

[9] Pinotti M，Toso R，Girelli D，et al．Modulation of factor Ⅶ levels by intron 7 polymorphisms：population and in vitro studies[J]．Blood，2000，95(11)：3 423-3 428．

(收稿 2016-01-20)

國家自然科學基金資助項目(No. 81273175)

R651.1+5

A

1673-5110(2016)19-0038-03

△通訊作者：趙黎明，Email：zhaoliming1201@126.com