新生兒缺氧缺血性腦病TLRs表達及分析

劉曉紅

河北邯鄲市中心醫院新生兒科 邯鄲 056001

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新生兒缺氧缺血性腦病TLRs表達及分析

劉曉紅

河北邯鄲市中心醫院新生兒科 邯鄲 056001

目的 分析新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)及相關細胞因子的表達，探索免疫系統在HIE發病過程中的作用。方法 收集入住我院66例HIE患兒，根據病情分為輕度、中度和重度3組，選取32例正常新生兒為對照組，應用ELISA法檢測IL-2、IL-4、TNF-α、TLR-4、TLR-9的表達水平。結果 HIE患兒IL-2、TNF-α、TLR-4、TLR-9表達增加(P<0.05)，且隨著病情嚴重程度而明顯增加(P<0.01)；IL-4在重度HIE中表達顯著減少(P<0.01)。 結論 新生兒缺氧缺血性腦病免疫應答主要以Th1誘導的細胞免疫應答為主；TLRs可作為治療靶點，為HIE的防治提供理論基礎。

新生兒缺氧缺血性腦病；Toll樣受體；細胞因子；免疫應答

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是圍生期由于窒息引起的嚴重并發癥之一，會導致腦組織缺氧缺血性損傷。新生兒缺氧缺血性腦病臨床癥狀多見新生兒出現意識障礙、肌張力改變以及驚厥等神經精神障礙，嚴重者發生腦癱、癲癇等HIE后遺癥，甚至威脅新生兒的生命[1-2]。HIE發生機制較為復雜，神經系統可通過分泌神經遞質、內分泌激素以及自身細胞產生的細胞因子調節免疫系統，而免疫系統則通過細胞免疫應答、體液免疫應答和固有免疫應答，以及免疫細胞分泌的細胞因子反饋作用于神經-內分泌系統，從而構成精密的神經-免疫-內分泌網絡[3-4]。近年來隨著對神經-免疫-內分泌網絡研究的深入，免疫系統功能異常在HIE的發生中的作用備受關注。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族在機體免疫功能調節中有重要作用，但目前對其在新生兒HIE中的表達研究較少。本研究分析HIE患兒血清TLR-4及TLR-9及相關細胞因子的表達，探索免疫系統在HIE發病過程中的作用，為進一步防治新生兒缺氧缺血性腦病提供理論依據。

1 資料與方法

1．1 研究對象 選取2013-01—2013-12入住我院兒科新生兒重癥監護室的HIE患兒66例，男36例，女30例；胎齡37～42(38±2)周；出生體質量2 200～2 500 g 10例，>2 500～4 000 g 38例，>4 000～4 500 g 18例；日齡1～3 d；母乳喂養11例，配方奶喂養36例，混合喂養19例；自然分娩26例，剖宮產40例；羊水清亮者9例，Ⅰ度糞染19，Ⅱ度糞染21例，Ⅲ度糞染17例。所有患兒符合足月新生兒HIE診斷標準。臨床分度：輕度21例，中度28例，重度17例。所有入選患兒符合2005年中華醫學會兒科學分會新生兒學組修訂的診斷標準。排除感染性疾病、肝腎功能受損等并發癥患者。隨機選擇同期入住我院產科正常新生兒32例為對照組，男18例，女14例；胎齡37～42(38±2)周；日齡1～3 d。2組性別、胎齡、體質量、產式等一般資料差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。2組新生兒無其他先天性疾病、感染病史、宮內發育遲緩。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象的直系親屬均簽署相關知情同意書。

1．2 研究方法

1．2．1 標本采集與處理：分別于出生1～3 d內對HIE組和對照組新生兒于08：00采集股靜脈血2 mL，靜置30 min后，在室溫條件下，以2 000 r/min的速度勻速離心 15 min后，留取上清液。對所取血清編號后，立即置于-80 ℃冰箱中凍存待用。

1．2．2 檢測方法：采用酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)檢測各細胞因子和TLRs的表達水平。IL-2、IL-4、TNF-α、TLR-4、TLR-9 ELISA檢測試劑盒分別購自R&D System公司。實驗操作步驟按照ELISA試劑盒說明進行。主要操作步驟包括：取出96孔板，加50 μL依次稀釋的標準品于相應的反應孔中，制備標準曲線。加50 μL待檢樣品于反應孔中。每個樣品做3個復孔。洗板5次，即棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37 ℃溫育30 min。洗板5次。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。取出酶標板，每孔加終止液50 μL，終止反應(此時藍色立轉黃色)。以空白孔調零，在450 nm波長下應用Labsystem Version1.3.1 酶標儀測量各孔的吸光度值(OD值)。 測定應在加終止液后15 min內進行。根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

2 結果

2．1 TLR-4、TLR-9檢測 應用ELISA法檢測Toll樣受體(TLRs)TLR-4和TLR-9在不同程度HIE患兒血清中的表達。各組HIE患兒TLR-4和TLR-9分別與正常對照組比較，輕度HIE患兒組TLR-4表達量有所增加，但與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。中度和重度HIE患兒組中TLR-4表達量明顯增加，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著病情的嚴重程度增加，TLR-4表達量增加更加明顯(P<0.01)。TLR-9在不同程度HIE患兒組中表達量變化與TLR-4相似，即在輕度HIE患兒組中表達增加，與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。但在中度和重度HIE患兒中TLR-4表達量明顯增加，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同程度HIE患兒血清TLRs表達變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，**P<0.01

2．2 HIE患兒細胞因子表達變化 輕度HIE患兒組IL-2表達量略降低，但與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。中度和重度HIE患兒組中IL-2表達量明顯增加，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著病情的嚴重程度增加，IL-2增加更加明顯(P<0.01)。IL-4在輕度和中度HIE患兒組中表達量無明顯變化，與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。但在重度HIE患兒的IL-4表達量明顯降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。而TNF-α在不同程度HIE患兒組中的表達與IL-2表達類似，區別于IL-4，各組HIE患兒血清中可檢測到TNF-α表達增加，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著病情的嚴重程度，TNF-α增加更加明顯(P<0.01)。見表2。

表2 不同程度HIE患兒血清細胞因子表達變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，**P<0.01

3 討論

新生兒由于免疫功能發育不完善，易受到包括低體質量、窒息、早產、宮內感染等多種因素影響，因此新生兒期是敏感時期。如新生兒在圍生期由于母胎血氣交換障礙，導致新生兒血氧濃度降低，易發生新生兒窒息，進而引發HIE，重者遺留嚴重的神經系統后遺癥[5]。隨著對新生兒免疫機制的研究不斷深入，探索HIE免疫因素相關發病機制日益受到重視。

TLRs是一大類能識別病原體的模式分子，識別病原微生物高度保守的PAMPs，激活特異性信號轉導途徑，連接機體固有免疫應答與適應性免疫應答，不僅可以活化固有性免疫應答，還可引起細胞因子釋放，上調并刺激分子的表達，而進一步刺激并活化獲得性免疫應答。在機體抗感染過程中發揮極為重要的作用。TLRs分子具有不同的識別譜，入侵病原體不同，引發一個或多個TLRs家族成員表達變化，免疫系統借此區別入侵的病原微生物，產生不同的細胞因子，誘導不同免疫應答形式清除病原體[6-7]。雖然近年研究中有TLRs在缺血缺氧性腦損傷中的報道[8-10]，但針對新生兒HIE的報道少見。

TLR-4分布廣泛，對革蘭陽性菌的肽聚糖、磷酸和革蘭陰性菌的鞭毛蛋白具有識別作用。既往研究證實，TLR-4在小鼠缺氧缺血性腦病中表達上調[9]。本研究得到類似結果，證實在不同程度新生兒HIE中相應TLR-4表達增加，雖病情嚴重程度增加，表達增加更加明顯。TLR9是近年研究較多的TLRs家族成員，但對TLR-9在缺氧缺血性腦病中表達尚未見相關報道。本研究表明，TLR-9在不同程度新生兒HIE中表達增加，且與病情嚴重程度呈正相關。我們進一步檢測了TLRs的相關細胞因子IL-2、IL-4、TNF-α的表達情況，結果發現，各組HIE患兒IL-2和 TNF-α表達增加，而IL-4在輕度和中度HIE患兒組中表達量無明顯變化，但在重度HIE患兒的IL-4表達量明顯降低。

Th1/Th2細胞由Th0細胞分化而來，Th0細胞的分化方向受抗原的性質(如不同的微生物)、局部環境及細胞因子及細胞內關鍵轉錄因子調控，如細胞因子IL-12、干擾素，轉錄因子STAT1、STAT4、IRF1促使Th0向Th1細胞分化。細胞因子IL-4、IL-10，轉錄因子STAT6、IRF4和GATA-3促使Th0向Th2細胞分化。Th1類細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細胞因子，介導細胞免疫；Th2類細胞主要分泌IL-4、IL-10等，介導體液免疫。Th1和Th2之間相互調節，相互制約，處于動態平衡，因此可以維持機體正常的細胞免疫和體液免疫。Th1/Th2細胞平衡的失調尤其Th1細胞的數量增加和功能亢進可能加劇了其炎癥的發生和發展[11]。Th1和Th2細胞因子互相抑制彼此表型的分化和功能，即Th1型細胞因子的產生可下調Th2型免疫應答，反之亦然。

本研究發現，新生兒HIE可引起TLRs表達增加，IL-2、TNF-α等Th1細胞因子上調明顯，占明顯優勢，而TLR9也以誘導Th1免疫反應為主。作為Th2分泌的細胞因子——IL-4表達降低。因此，新生兒HIE可能激發Th1誘導的細胞免疫應答為主，而TLR-4、TLR-9作為靶標治療可能緩解新生兒HIE的發生和發展。

[1] Nestaas E，Skranes JH，St?ylen A，et al．The myocardial function during and after whole-body therapeutic hypothermia for hypoxic-ischemic encephalopathy，a cohort study[J]．Early Hum Dev，2014，90(5)：247-252．

[2] Khan RH，Islam MS，Haque SA，et al．Correlation between grades of Intraventricular Hemorrhage and severity of hypoxic ischemic encephalopathy in perinatal asphyxia[J]．Mymensingh Med J，2014，23(1)：7-12．

[3] Templeton JP，Freeman NE，Nickerson JM，et al．Innate immune network in the retina activated by optic nerve crush[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54(4)：2 599-2 606．

[4] Reardon C，Duncan GS，Brüstle A，et al．Lymphocyte-derived ACh regulates local innate but not adaptive immunity[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(4)：1 410-1 415．

[5] Patel SD，Pierce L，Ciardiello AJ，et al．Neonatal encephalopathy：pre-clinical studies in neuroprotection[J]．Biochem Soc Trans，2014，42(2)：564-568．

[6] Marsh B，Stevens SL，Packard AE，et al．Systemic lipopolysaccharide protects the brain from ischemic injury by reprogramming the response of the brain to stroke：a critical role for IRF3[J]．J Neurosci，2009，29(31)：9 839-9 849．

[7] Mas＇lińska D，Laure-Kamionowska M，Mas＇liński S．Toll-like receptors in rat brains injured by hypoxic-ischaemia or exposed to staphylococcal alpha-toxin[J]．Folia Neuropathol，2004，42(3)：125-132．

[8] Hickey E，Shi H，Van Arsdell G，et al．Lipopolysaccharide-induced preconditioning against ischemic injury is associated with changes in toll-like receptor 4 expression in the rat developing brain[J]．Pediatr Res，2011，70(1)：10-14．

[9] Salama M，Farrag SM，abulasrar SA，et al．Up-regulation of TLR-4 in the brain after ischemic kidney-induced encephalopathy in the rat[J]．CNS Neurol Disord Drug Targets，2013，12(5)：583-586．

[10] Stridh L，Mottahedin A，Johansson ME，et al．Toll-like receptor-3 activation increases the vulnerability of the neonatal brain to hypoxia-ischemia[J]．J Neurosci，2013，33(29)：12 041-12 051．

[11] Osakwe CE，Bleotu C，Chifiriuc MC，et al．TH1/tH2 cytokine levels as an indicator for disease progression in human immunodeficiency virus type 1 infection and response to antiretroviral therapy[J]．Roum Arch Microbiol Immunol，2010，69(1)：24-34．

(收稿2015-10-05)

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A

1673-5110(2016)19-0051-03