基于GC-TOF/MS技術的轉Bt基因大米代謝組學研究

程建華，桑志紅，李海靜，吳勝明，夏 晴，董方霆

(軍事醫學科學院生物醫學分析中心，北京 100850)

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基于GC-TOF/MS技術的轉Bt基因大米代謝組學研究

程建華，桑志紅，李海靜，吳勝明，夏 晴，董方霆*

(軍事醫學科學院生物醫學分析中心，北京 100850)

基于GC-TOF/MS技術對來源于兩個不同產地的轉Bt基因及其親本大米進行了代謝組學研究。從大米樣本中共檢出774個色譜峰，鑒定出278種代謝產物，包括糖、氨基酸、脂肪酸及有機酸等代謝產物。對轉Bt基因及其親本大米進行主成分分析，結果表明，轉Bt基因與親本大米的代謝組之間無明顯差異性，進一步對數據進行偏最小二乘判別分析和方差分析，僅甘油和鼠李糖兩種代謝產物濃度在轉Bt基因大米及其親本大米間存在一定差異(分別升高1.55和3.32倍)；考察了不同產地對大米代謝組的影響，結果表明武漢和海南兩個產地的大米代謝組之間存在明顯差異，有15種代謝產物在不同產地的親本大米之間以及不同產地的轉基因大米之間均發生顯著變化。應用GC-TOF/MS技術對來源于不同產地的轉Bt基因大米及其親本大米的代謝組進行比較研究，結果表明引入外源Bt基因對實驗中的水稻機體內代謝未產生明顯影響，產地差異造成的大米間代謝組差異比引入外源Bt基因造成的大米間代謝組差異更為顯著。

轉基因大米；代謝組學；差異代謝產物；多元統計分析；氣相色譜-飛行時間質譜聯用(GC-TOF/MS)

轉基因農作物用于生產和消費的時間相對較短，其安全性受到人們的廣泛關注。外源基因的引入有可能使受體植物的能量代謝和物質代謝發生變化，并影響受體植物原有表型性狀和遺傳性狀的改變[1]，也可引起植物的營養成分和代謝產物的含量發生變化，甚至使轉基因作物產生一些新的毒性物質[2]。目前，雖然缺乏足夠的證據證實轉基因作物對人類和環境是否存在危害，但所有學者認為轉基因作物及其產品在進入消費市場前必須經過嚴格科學的安全評估[3]。

基于轉基因作物與其親本作物的組學比較研究是近年興起的一個評價轉基因作物安全性的有效手段。其中，代謝組學技術在轉基因作物安全性評價領域具有更獨到的優勢，由于代謝產物的種類遠少于基因和蛋白的數目，代謝物在生物體液或組織分布均勻，利用代謝組學技術可以更靈敏、更準確地監測生物體系的狀態及動態變化。近年來，人們利用代謝組學技術對玉米[4]、大豆[5]、土豆[6-7]、黃瓜[8]、棉籽[9]、葡萄[10]、木瓜[11]、水稻[12]、番茄[13]等轉基因農作物進行了深入研究，從代謝終端的角度對轉基因作物因引入外源基因可能造成的代謝途徑變化機制、農作物的非預期效應和食用安全性進行了評估。

蘇云金桿菌(Bacillusthur-ingiensis，Bt)能產生一種殺蟲晶體蛋白，這種蛋白被鱗翅目類昆蟲取食后在消化系統中降解為活性肽，并與昆蟲受體蛋白結合，引起細胞膜破裂，最終導致昆蟲癱瘓或死亡。轉Bt基因水稻是利用轉Bt基因技術從蘇云金桿菌中分離出編碼這種蛋白的基因，經修飾改造后導入水稻細胞中，使其自身產生這種晶體蛋白而具有抗蟲特性的水稻品種。本實驗利用基于氣相色譜-飛行時間質譜聯用(GC-TOF/MS)的代謝組學技術對來源于兩個不同產地的轉Bt基因大米及其親本大米的代謝組進行比較分析，獲得轉Bt基因大米與親本大米之間的差異性代謝產物，分析水稻因引入外源Bt蛋白可能造成的代謝通路變化，從代謝終端為轉Bt基因大米的安全性評價提供了新依據。

1 實驗部分

1.1 實驗用品

轉Bt基因水稻“華恢1號”及其親本作物“汕優63”由華中農業大學張啟發和林擁軍教授提供。水稻采自海南和武漢實驗田，收割的水稻經去皮、精制后真空低溫(-20 ℃)保存。HPLC 級甲醇、氯仿和吡啶購于北京化學試劑公司；核糖醇以及衍生劑鹽酸甲氧胺、N-三甲基硅-三氟乙酰胺(MSTFA)和氯三甲基硅烷(TMCS)購于Sigma Aldrich(St.Louis，MO，USA)；超純水(18.2 MΩ·cm) 采用Millipore Milli-Q Gradient system 制備(Millipore Corp.，MA，USA)。

1.2 樣品前處理

將大米粉碎后過200目篩，精確稱取各種大米粉末100.0 mg，置于1.5 mL EP管中，向其中加入600 μL二氯甲烷、200 μL甲醇以及200 μL去離子水，渦旋1 min，充分混勻；再加入20 μL的0.2%核糖醇溶液，充分混勻后超聲提取3次，每次15 min，并浸泡過夜，再以13 000 r/min離心15 min，取上層清液，用N2在45 ℃下吹干。每種大米各取4個平行樣本。

向吹干的提取物中加入40 μL 20 mg/mL鹽酸甲氧胺的吡啶溶液，渦旋30 s，充分混勻，在30 ℃下以130 r/min孵育90 min；充分反應后，再加入40 μL MSTFA(含1% TMCS)，充分混勻，在37 ℃下氣浴30 min，取出，室溫下放置120 min后，保存于4 ℃冰箱待測。

1.3 GC-TOF/MS分析

采用LECO Pegasus 4D GC-TOF/MS系統(LECO公司，美國)進行檢測分析，該系統包括：Agilent 7890 GC，串聯LECO Pegasus 4D TOF/MS檢測器，Gerstel MPS自動進樣系統(Tegent Scientific Ltd.美國)。色譜柱Rsi-5MS(30 m×250 μm×0.25 mm)和RTX-200(1.8 m×180 μm×0.20 mm)，購于瑞斯泰克公司。程序升溫：初始溫度為70 ℃，保持1 min；以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。載氣為氦氣，流速為1 mL/min；進樣體積：1 μL；分流比為1∶5。溶劑延遲時間設為330 s，進樣口、傳輸線和離子源溫度分別設為250，250，220 ℃。電子轟擊電離(70 eV)，檢測器電壓為1 550 V，質量掃描范圍設為50～800m/z，采集速度為10 spectrum/s，信噪比設為50。

1.4 數據分析

將GC-TOF/MS采集的原始數據，經LECO Pegasus 4D ChromaTOF 4.5軟件(含NIST 10譜庫和Fiehn代謝產物質譜庫等)進行峰對齊、去卷積、峰檢索，根據相似度獲得色譜峰所對應的化合物名稱，再利用內標物核糖醇進行歸一化處理。將處理好的數據導出，并利用Simca 10.0軟件對數據進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)等多元統計分析。通過PCA和PLS-DA的得分圖分析組內和組間樣本代謝組的差異性，再根據載荷圖和變量對分組貢獻值的大小(VIP)篩選組間可能的差異性代謝產物。將篩選出的組間差異物及其峰面積導入SPSS 13.0軟件進行方差分析(ANOVA)，獲得組間變化具有顯著性(P<0.05)的差異代謝產物。

2 結果與討論

2.1 大米樣本的GC-TOF/MS總離子流圖

利用ChromaTOF 4.5軟件的統計比較功能，對GC-TOF/MS采集的16個大米樣本的原始數據進行峰對齊、去卷積、峰檢索等處理后，檢出信噪比大于50的色譜峰共774個。利用NIST 10和Fiehn等譜庫進行峰檢索，指認出包括糖類、氨基酸類、有機酸類、脂肪酸類及其他代謝產物278種。各組樣本的總離子流色譜圖的比對分析顯示，同一產地的轉Bt基因大米與親本大米樣本間的色譜峰無明顯的差異性，而不同產地間大米的總離子流圖存在一定的差異性(見圖1)。

圖1 大米樣本的GC-TOF/MS總離子流圖Fig.1 GC-TOF/MS total ion current(TIC) chromatograms of rice samples

2.2 轉基因大米與其親本大米之間代謝組學比較

原始數據經對齊、去卷積和歸一化處理后導出，用SIMCA-10.0進行主成分分析(PCA)，對兩個不同產地的轉Bt基因和親本大米分別進行PCA分析。

對16個大米樣本進行PCA分析(圖2A)，發現產地為武漢的轉Bt基因大米和親本大米的代謝組之間無明顯的分離趨勢，表明該產地的親本大米和轉基因大米的代謝組之間無明顯的差異性。PCA分析得到的模型擬合度參數[14-15]R2X(cum)為0.668，說明模型的3個主成分能解釋66.8%的X變量，Q2(cum)為0.224，表明模型預測能力較低。由于兩種樣本間沒有明顯的分離趨勢，因此圖2B中分布的代謝物也不具有一定的差異指向性，需要進一步分析。

進一步對數據進行有監督的PLS-DA分析(圖3A)，武漢轉Bt基因大米和親本大米之間存在明顯的分離和聚集趨勢，而且模型參數得到進一步改善：擬合度參數R2X(cum)為0.511，R2Y(cum)為0.943，表明模型的2個主成分能解釋51.1%的X變量和94.3%的Y變量，利用正交驗證可通過該模型進行預測的變量達到82.7%。根據PLS-DA分析獲得的載荷圖和變量對分組貢獻值(VIP，Variable importance in the projection)的大小，篩選出51個VIP>1.0的變量(圖3B)，包括糖類、有機酸類、脂肪酸類和氨基酸類等。將這51種代謝產物進一步用SPSS進行方差分析，發現29種具有顯著差異(P<0.05)的代謝產物，其中，在轉Bt基因大米中顯著高于親本大米的代謝物有4種，包括海藻糖、鼠李糖、麥芽糖和山梨醇，變化最大的是海藻糖和鼠李糖。在轉基因大米中降低的代謝物有3種，包括半乳糖、吡喃半乳糖苷和葡萄糖酸，轉Bt基因大米中的葡糖酸僅為親本大米中的0.05倍。上述5種脂肪酸在轉Bt基因大米中的濃度水平均顯著高于親本大米，變化倍數為1.27～2.53倍。而4種有機酸在轉Bt基因大米中的濃度水平均低于親本大米，僅為親本大米的0.38～0.75倍。

同樣，將產地為海南的轉Bt基因和親本大米進行PCA和PLS-DA分析。由PCA分析可知，親本和轉Bt基因大米樣本的代謝組之間無顯著差異。進一步做PLS-DA分析，發現47種VIP>1.0的變量，其中經ANOVA分析獲得P<0.05的差異物有23種，包括11種糖類物質、4種氨基酸、1種脂肪酸、2種有機酸和5種其他化合物。

通過分別對產地為武漢和海南的轉Bt基因和親本大米的分析表明，這兩個產地的轉Bt基因和親本大米之間共有50種代謝產物發生了顯著變化(見圖4A)，包括糖類、氨基酸類、脂類和有機酸類等，其中僅有7種代謝產物在兩個不同產地的親本和轉Bt基因大米之間發生了顯著變化(見表1)。而與親本大米比較，這7種代謝產物中僅甘油和鼠李糖在兩種產地的轉Bt基因大米中均出現上調趨勢，且上調幅度非常接近，產地為武漢的分別上調1.55倍和3.32倍，產地為海南的分別上調1.69倍和3.17倍；其他5種代謝產物在轉Bt基因大米和親本大米中也出現兩種不同的變化趨勢。利用MetaboAnalyst 3.0和KEGG軟件分析發現，鼠李糖和甘油主要涉及多種糖代謝和甘油脂代謝途徑。

NoRetentiontime(s)DifferentialmetaboliteOrigin-WuhanOrigin-HainanVIPPvaluen?fold(G/P)VIPPvaluen?fold(G/P)1824874Ethanolamine(乙醇胺)a1833002080581833002080582837526Glycerol(甘油)b8546001911558546001911553169208Glucopyranoside(吡喃葡萄糖)a4383000600434383000600434174882Sorbitol(山梨醇)b2054001471902054001471905183086Gluconicacid(葡萄糖酸)a2304000960052304000960056256711Trehalose(海藻糖)a2156000004112156000004117292881Rhamnose(鼠李糖)b115100000332115100000332

VIP means variable importance in the projection using PLS-DA；superscript “a” means those compounds which similarities are over 800 compared with mass spectrograms from NIST 10.0，but not compared with the mass spectrograms of standard compounds；superscript “b” means those compounds which similarities are over 800 compared with mass spectrograms from NIST 10.0 and mass spectrograms of standard compounds；n-fold means changing fold；“G/P” means peak area ratios of GM rice(G) to parental rice(P)(VIP為PLS-DA分析獲得的變量對分組的貢獻值，值越大表明變量對分組貢獻越大；a表示經質譜譜庫和譜圖比對分析獲得相似度大于800的化合物，但這些化合物未經標準物質質譜譜圖比對；b表示經質譜譜庫和譜圖比對分析獲得相似度大于800的化合物，且經標準物質質譜譜圖比對一致；n-fold表示變化倍數，“G/P”表示轉Bt基因組(G)與親本組(P)峰面積均值的比值)

2.3 不同產地大米之間代謝組學的比較

水稻生長的自然環境(如溫度、濕度、光照、土壤、水等)對水稻的生長會產生重要影響，所以不同產地的大米的代謝組可能存在明顯的差異性。為此，對海南和武漢產地4組大米樣本按產地不同分別進行分析。

將兩個產地的親本大米進行PCA分析和PLS-DA分析，從PLS-DA得分圖(圖4A)可以看出，兩種不同產地的大米樣本具有明顯的分離趨勢，表明產地為武漢和海南的兩組親本大米樣本的代謝組之間存在明顯差異。同樣從獲得的模型擬合參數R2X(cum)可以發現，3個主成分能解釋50.3%的X變量及96.1%的Y變量，利用正交驗證可通過該模型進行預測的變量達76.9%。進一步對兩組樣本進行PLS-DA分析，利用載荷圖(圖4B)和VIP值，篩選出VIP>1.0的變量55個，且經ANOVA分析獲得P<0.05的代謝產物共37種，包括14種糖類、8種脂類、2種氨基酸、2種有機酸類和11種其他化合物。

同樣，對兩個不同產地的轉Bt基因大米進行PCA和PLS-DA分析，表明兩種產地的轉Bt基因大米的代謝組存在明顯差異。進一步通過PLS-DA分析獲得64個對分組貢獻值VIP>1.0的變量，其中有46種化合物在不同產地的兩組大米樣本中濃度水平發生了顯著變化(P<0.05)。

對僅產地不同的16個樣本進行代謝組分析發現，產地為武漢的大米與海南的大米共有68種代謝產物發生了顯著變化，包括糖類、有機酸類、脂類和氨基酸類物質。其中17種代謝產物在轉Bt基因大米和親本大米之間發生顯著變化(見表2)。在親本大米和轉Bt基因大米中，有15種化合物在武漢來源的大米中的濃度水平均低于海南來源大米中的濃度(見圖5)。

表2 兩種不同產地的大米之間均發生顯著性變化的代謝產物

(續表2)

NoRetentiontime(s)DifferentialmetabolitesParental-riceGM-RiceVIPPvaluen?fold(W/H)VIPPvaluen?fold(W/H)11193396Myo-inositol(肌醇)a41340005106349910000104512217103Galactinol(半乳糖醇)b10610002606814690000004713235239Mannosylglycerate(甘油甘露糖)b13590028206811810000007114239959Nicotianamine(尼克酰胺)a10750005007711560001006715256711Trehalose(海藻糖)b19770009402212120000016616264197Squalene(角鯊烯)b13720002808114300018707317299447Unknown(未知物)c102300001081152900002043

“W/H” means peak area ratios of rice samples between Wuhan and Hainan；superscript “a” and “b” have the same meaning as the words in Table 1；superscript “c” means those compounds which similarities are not more than 800 compared with mass spectrograms from NIST 10.0.(W/H”表示產地為武漢的(W)與產地為海南的(H)峰面積均值的比值，a,b,n-fold的意義與表1同，c表示經質譜譜庫和譜圖比對分析獲得相似度小于800的化合物)

圖5 不同產地大米之間的發生顯著變化的代謝產物Fig.5 Significant differential metabolites between two different origins，Wuhan and Hainan

2.4 代謝途徑分析

本實驗基于GC-TOF/MS技術對來源于兩個不同產地的轉Bt基因大米及其親本大米進行了代謝組學研究。從大米樣本中共檢出774個色譜峰，鑒定了包括糖、氨基酸、脂肪酸、有機酸等代謝產物在內的278種代謝產物。轉Bt基因大米及其親本大米的主成分分析結果表明，轉Bt基因與親本大米的代謝組學之間無明顯差異；對產地對大米代謝組的影響的分析結果表明，武漢和海南兩個產地的大米代謝組之間存在明顯差異。引入外源Bt基因對實驗中的水稻機體內代謝未產生明顯的影響，產地差異造成的大米間代謝組差異比引入外源Bt基因造成的大米間代謝組差異更為顯著。

近年來各國學者采用代謝組學技術對多種轉基因農作物進行了深入研究[16-17]。根據已有文獻，引入外源基因后，植物代謝終端因外源基因的引入發生了一定程度的變化，這種變化可能沒有更多的生理學意義，也可能是引入外源基因所期望的功能性變化，或是農作物非預期效應的一種表現。Takahashi等[18]利用CE-MS考察了轉Bt基因大米及其親本大米中的極性代謝產物，包括糖酵解、三羧酸循環和五碳糖磷酸途徑中的一些重要代謝產物。結果顯示，與含潮霉素抗性基因的水稻相比，YK1(調控二氫黃酮醇-4-還原酶活性的基因)過表達水稻根系和愈傷組織中僅部分代謝產物發生了微小的變化，研究認為盡管這些發生微小變化的代謝產物與引入外源基因沒有直接關系，但可能與提高愈傷組織中谷胱甘肽、根系中的NADPH和二氫黃酮醇-4-還原酶的濃度水平存在潛在的關系。Jia等[19]報道了轉Bt基因水稻汕優63在生長前期可溶性糖的含量顯著低于非Bt水稻，但在后期顯著高于非Bt水稻。Sana等[20]對轉Bt基因抗白葉枯病水稻進行代謝組學等多種方法分析時發現，多種氨基酸(酪氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、氧脯氨酸等)在轉Bt基因水稻的稻葉中出現了顯著上調，可能有助于水稻抵抗細菌感染。

本文通過對基于GC-MS的轉Bt基因大米及其親本大米的代謝組學研究，未發現轉Bt基因大米與其親本大米的代謝組之間具有明顯的差異性。所檢測的278種代謝產物中，僅甘油和鼠李糖兩種代謝產物的濃度在轉Bt基因大米中顯著高于其親本大米。甘油是甘油脂代謝通路中的重要產物[21]。利用MetaboAnalyst軟件進行富集分析，并基于KEGG進行代謝通路檢索，可知鼠李糖涉及多個代謝途徑[22]，包括半乳糖代謝、聚酮糖單元的合成、果糖和甘露糖的代謝以及氨基糖和核苷酸糖的代謝等。由于上述兩種代謝產物在轉Bt基因的大米中變化幅度不大，分別是其親本大米中的1.55倍和3.32倍，且本研究未獲得在兩個不同產地均具有相同變化趨勢并且發生顯著變化的更多的差異性代謝產物，甘油和鼠李糖兩種代謝產物是否能夠確切地反映引入外源Bt蛋白后機體中終端代謝真實發生的變化，這些代謝產物是否與外源Bt基因的引入存在關聯，還需更多的實驗加以證實。

利用MetaboAnalyst中的富集分析和KEGG代謝通路檢索，對兩種不同產地的大米中變化趨勢相似的15種差異代謝產物進行分析，發現這些代謝產物涉及的代謝通路非常廣泛，主要包括：果糖和甘露糖降解、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、核苷酸糖代謝、酪氨酸代謝、苯丙氨酸和酪氨酸代謝、固醇類生物合成、蛋白生物合成、肌醇代謝、三羧酸循環等代謝途徑。這表明產地的差異對水稻機體的多種終端代謝途徑造成了非常明顯的影響。

影響水稻生長的因素非常復雜，其中溫度與光照是兩個最為重要的因素[23]。本實驗中的兩種大米來源于兩個完全不同的氣候帶，海南屬于熱帶季風氣候，而武漢屬于亞熱帶季風氣候。水稻的整個生長階段(包括：苗期、分蘗期、有穗分化期、抽穗揚花期和灌漿成熟期)都適宜在高溫(30 ℃左右)、多濕的環境，對土壤的要求相對較低[24]。高溫條件能增強水稻的光合作用和根葉的呼吸作用，溫度過高和過低會影響光合作用的效率和根葉的呼吸作用。本實驗的15種差異性代謝產物在產地為海南的大米中的濃度水平高于武漢大米中的濃度水平，這可能是由于海南具備更好的溫度和濕度條件滿足水稻的生長，其機體的代謝機能更為活躍。

3 結 論

本文基于GC-MS的代謝組學技術對兩種不同產地的轉Bt大米及其親本大米進行了代謝組學分析。PCA分析表明，轉Bt基因大米和親本大米的代謝組之間無明顯差異，進一步的PLS-DA分析結果表明，轉Bt基因大米中僅甘油和鼠李糖兩種代謝產物高于其親本大米中的濃度水平，但差異性較小，變化幅度不超過3.5倍；對水稻生長地域差異性的分析表明，兩種產地的大米中有15種代謝產物發生了顯著變化，且產地為海南的大米中的濃度水平均高于產地為武漢的大米，這可能是海南的海洋性熱帶季風氣候更適合于水稻的生長。從以上分析結果可以看出，產地的不同(武漢和海南)對大米機體代謝造成的差異性大于引入外源Bt基因造成的差異性。

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Metabolomic Analysis of Bt-transgenic and Parental Rice Based on Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHENG Jian-hua，SANG Zhi-hong，LI Hai-jing，WU Sheng-ming，XIA Qing，DONG Fang-ting*

(Center of Biomedical Analysis,Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China)

In this study，Bt-transgenic and parental rice from two places(Wuhan and Hainan) was analyzed using gas chromatography-mass spectrometry-based metabolomics.774 chromatographic peaks were detected using GC-TOF/MS.Among them，278 metabolites，including carbohydrates，amino acids，fatty acids，organic acids and other compounds，were identified.The results showed that the difference of metabolome was not significant between the Bt-transgenic and parental rice using the principal component analysis method.Further partial least squares discriminant analysis，only two concentrations of glycerol and rhamnose were changed between Bt-transgenic and parental rice,rising 1.55 times and 3.32 times,respectively,compared to that of parental rice.The factor of producing origins of rice was investigated.15 metabolites have significant between two origins rice from Wuhan and Hainan.GC-TOF/MS-based metabolomic method was successfully used in comparative analysis of Bt-transgenic and parental rice,which suggested that it has no significant effect to transform exogenous Bt gene into rice cells，and the factor of rice producing origin is more noticeable.

genetically modified rice；metabolomics；differential metabolites；multivariate statistical analysis；GC-TOF/MS

2016-03-03；

2016-06-14

國家科技重大專項-轉基因生物新品種培育(2014ZX08011007，2016ZX08011007)；國家重大科學儀器設備開發專項(2012YQ180117)

研究報告

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.001

O657.63；X503.231

A

1004-4957(2016)10-1217-08

*通訊作者：董方霆，研究員，研究方向：代謝組學，Tel：010-66930338，E-mail：dft@proteomics.cn