TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯質譜法快速測定動物源性食品中聚醚類抗生素的研究

曹亞青,宋 歌,王曼曼，王學生*，艾連峰*

(1.華北理工大學 公共衛生學院，河北 唐山 063000；2.河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050000)

?

TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯質譜法快速測定動物源性食品中聚醚類抗生素的研究

曹亞青1,宋 歌2,王曼曼1，王學生1*，艾連峰2*

(1.華北理工大學 公共衛生學院，河北 唐山 063000；2.河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050000)

建立了TurboFlow在線凈化/液相色譜-串聯質譜法快速同時測定牛奶、雞肉和雞蛋中拉沙洛菌素、鹽霉素、莫能菌素、甲基鹽霉素、馬杜霉素和尼日利亞菌素殘留的方法。樣品提取液經在線凈化柱Cyclone-p凈化，Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm × 2.1 mm，5 μm)色譜柱分離，電噴霧正離子模式測定，整個分析過程僅13 min。方法在1～100 μg/L范圍內呈良好線性關系(r≥0.999)，定量下限為1 μg/kg，在動物源性食品中3個加標水平下的回收率為71.9%～109.0%，相對標準偏差為1.5%～14.9%。

TurboFlow在線凈化；液相色譜-串聯質譜；聚醚類抗生素；動物源性食品

聚醚類抗生素(Polyether antibiotics)又名離子載體抗生素，作為高效、廣譜的抗球蟲藥和促生長劑已廣泛應用于畜禽飼養業。然而聚醚類抗生素的不合理使用會導致動物產品中的獸藥殘留，從而危害食用者的健康。加拿大、美國、日本和中國對食品中聚醚類抗生素的最大殘留限量進行了嚴格規定，低至0.008 mg/kg；歐盟規定在飼料中禁止使用莫能菌素、鹽霉素[1-3]。我國是農業大國，日常獸藥殘留檢測工作繁重。因此，建立準確、快速的動物源性食品中聚醚類抗生素的殘留分析方法十分必要。

目前，聚醚類抗生素殘留檢測主要采用液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質譜法(LC-MS)[4-8]。但由于食品組成復雜，且被分析物處于痕量狀態，需富集才能檢出，因此，樣品前處理成為食品分析過程中的必要環節。通常，樣品預處理占用整個分析方法所用時間的2/3；對于聚醚類抗生素前處理目前多采用離線的固相萃取法，步驟較多、耗時，易出現人為操作誤差和污染。TurboFlow在線凈化技術結合了擴散、化學和體積排阻的原理，凈化柱為第一維色譜柱系統，樣品通過凈化柱凈化、富集后進入切換閥的接口，經捕集后，切換進入分析柱(第二維色譜柱)和檢測器，即在捕獲目標分析物的同時快速凈化樣品。同時，商品化的凈化柱可重復使用，簡化了前處理操作，降低了測定成本。由于方法簡單快速，自動化程度高，該技術已成功用于食品中化學污染物的分析測定[9-16]。

本文采用TurboFlow在線凈化技術進行樣品預處理，液相色譜-串聯質譜技術進行分離檢測，從而實現了動物源性食品中聚醚類抗生素殘留的分析，方法簡便、靈敏度高，可用于動物源性食品中聚醚類抗生素的快速定性定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TurboFlow在線凈化液相色譜串聯質譜儀(LC-MS/MS，美國Thermo Fisher公司)：包括CTC多功能自動進樣器、兩個四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra三重四極桿質譜儀。AH-20全自動均質器(中國睿科儀器有限公司)；3K15高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。

乙腈、丙酮、甲醇(色譜純，美國Fisher 公司)。聚醚類抗生素標準品：拉沙洛菌素(純度98.0%)、鹽霉素(75.5%)、莫能菌素(98.0%)、馬杜霉素(85.5%)均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲基鹽霉素(98.0%)購自加拿大TRC公司；尼日利亞菌素(98.0%)購自英國Apollo Scientific Limited公司；用甲醇配制濃度為1 mg/mL的標準儲備液，冷藏、避光保存。

1.2 樣品前處理

稱取牛奶、均質的雞肉和雞蛋樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈和5 g無水硫酸鈉。雞肉和雞蛋樣品均質提取1 min，牛奶渦旋振蕩提取1 min；樣品以10 000 r/min離心10 min后用10 mL乙腈再次提取，合并上清液，分取5 mL上清液氮吹至干，準確加入1 mL甲醇-水(體積比8∶2)溶解殘渣，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

圖1 在線凈化模式及流路模式切換圖Fig.1 The modes of on-line SPE systemA：loading and washing；B：eluting

1.3 在線凈化色譜條件

在線凈化程序包括凈化(上樣泵)和分離(分析泵)，凈化步驟主要靠其配置的四元耐壓泵驅動，樣品在凈化柱上凈化和富集；經過以上步驟后，通過閥切換技術，將凈化后的物質在分析柱上進行分離和分析，程序中各步所用流路模式見圖1。以Cyclone-p柱(50 mm× 0.5 mm，60 μm)為固相萃取柱，流動相A為0.5%甲酸水溶液，B為乙腈，C為丙酮-乙腈-異丙醇(體積比1∶1∶1)，進樣體積為50 μL。分析柱為Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm×2.1 mm，5 μm)，流動相A為0.5%甲酸水溶液，流動相B為乙腈。在線凈化程序見表1，其中凈化過程(OCC)在程序中每步的變化采用瞬變模式，而HPLC采用漸變模式。整個分析時間需13 min，在2.5 min開始至第3 min切入質譜系統。

1.4 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，溫度：300 ℃；毛細管電壓：3 200 V；多反應監測(MRM)正離子掃描模式；鞘氣壓力：30 units；輔助氣壓力：5 units；離子源溫度：320℃；源內誘導解離電壓：10 V；Q1,Q3單位分辨率：0.7 U；其他測定條件見表2。

表1 在線凈化和液相色譜-質譜分析動物源性食品中聚醚類抗生素的實驗條件

表2 分析物的保留時間和MRM分析質譜參數

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 提取條件優化

聚醚類抗生素易溶于中等極性有機溶劑，因此實驗分別采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和異辛烷作為提取溶劑進行提取。結果發現，甲醇、乙酸乙酯和異辛烷提取的雜質較多，回收率均達不到80%，而選用乙腈提取時回收率均大于70%，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 TurboFlow凈化條件的建立

TurboFlow在線凈化過程主要包括上樣、洗脫、轉移和淋洗步驟。實驗采用不接分析柱，分流進入質譜方式優化各步條件。考慮到聚醚類化合物屬中等弱極性化合物，所以選擇具有類似反相柱性質的Cyclone-p為凈化柱，分別考察了甲酸(0.5%和0.1%)水溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液以及10 mmol/L乙酸銨-0.1%乙酸水溶液作為上樣流動相時對6種聚醚類抗生素的影響。結果顯示，6種聚醚類抗生素在以上流動相條件下均能有效保留，當以0.5%甲酸水溶液為上樣液時，6種聚醚類抗生素的峰形最佳、響應值最高，即上樣損失率最低，所以選擇0.5%甲酸水溶液作為上樣流動相。

實驗考察了不同比例的乙腈和0.5%甲酸水溶液流動相對目標化合物的洗脫效果。結果顯示極性最大的拉沙洛菌素需使用100%乙腈才能洗脫完全，故采用乙腈作為洗脫溶劑。

2.3 分離條件的建立

凈化柱洗脫下的目標物通過分析柱進行分離，凈化過程的洗脫液和分離時HPLC流動相的初始比例會影響目標化合物的峰形及分離度。實驗分別選擇0.5%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液以及10 mmol/L乙酸銨-0.1%乙酸水溶液作為水相，有機相分別為甲醇和乙腈，進行流動相的選擇實驗。結果發現，以0.5%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機相，采用時間梯度洗脫條件時(表1)，6種化合物的峰形最佳。

2.4 線性范圍與基質效應

選用牛奶、雞蛋和雞肉空白基質溶液配制濃度在1～100 ng/mL范圍的基質加標溶液及相同濃度的標準溶液。以分析物的峰面積(y)對標準溶液中被測組分的濃度(x，μg/L)作圖。以基質匹配標準曲線和標準溶液曲線斜率的比值(Ratio of slope)來考察基質效應的強弱，當兩者斜率的比值高于1.2或低于0.8時說明基質效應較強，影響結果的定量。以雞蛋樣品為例(如表3)，未使用在線凈化柱時，基質對分析物的響應具有抑制作用，響應值變低。使用在線凈化柱后，分析物具有基質增強或抑制作用，但明顯優于未使用在線凈化柱，且經過在線凈化柱后，所有化合物的線性相關系數均有提高，說明在線凈化柱具有一定的凈化效果。由于6種分析物斜率的比值大部分高于1.2或低于0.8，表明未能完全消除基質效應影響，所以實驗采用基質匹配曲線來校正結果。

表3 雞蛋基質溶液使用凈化柱與未使用凈化柱的凈化效果對比

2.5 回收率、精密度及定量下限

在優化條件下，選擇1，5，10 μg/kg 3個濃度水平進行加標回收率實驗，每個加標水平平行6個樣品，得方法回收率為71.9%～109.0%，相對標準偏差(RSD)為1.5%～14.9%(見表4)。

表4 方法回收率和相對標準偏差(n=6)

計算得方法的定量下限(LOQ，S/N=10)為1 μg/kg，可滿足我國對聚醚類抗生素所規定的最大殘留限量的測定要求。以牛奶樣品為例，圖2為空白牛奶樣品加標1 μg/kg聚醚類抗生素的MRM色譜圖，說明該方法能夠準確地檢測動物源性食品中的6種聚醚類抗生素。

2.6 實際樣品的測定

將該方法用于28份樣品的日常檢測，1份雞肉樣品中檢出馬杜霉素，其含量為5±0.5 μg/kg(n=3)，低于我國規定的動物源性食品中聚醚類抗生素的最高殘留限量。

3 結 論

本文建立了基于TurboFlow在線凈化技術對動物源性食品中聚醚類抗生素的檢測方法，滿足了國內外對該類物質的檢測要求。方法快速，僅需13 min，極大地節約了前處理時間，自動化程度高，凈化柱能夠重復使用(高于1 000針)，有利于大批量樣品的處理，保證了方法的穩定性及準確性。

[1] Liang C L，Cheng L L，Shen J Z，Zhang Y J，Zhang S X.Chin.J.Chromatogr．(梁春來，程林麗，沈建忠，張玉潔，張素霞.色譜)，2009，27(6)：815-819.

[2] China’s Food Safety Database(中國食品安全數據庫).http：//www.fsr.org.cn/.

[3] GB2763-2014.Maximum Residue Limits for Pesticides in Food.National Food Safety Standard of the People’s Republic of China(食品中農藥殘留最大限量.食品安全國家標準).

[4] Nász S，Debreczeni L，Rikker T，Eke Z.FoodChem.，2012，133(2)：536-543.

[5] Wang Y Y，Xia X，Li X W，Ding S Y，Shen J Z.Chin.J.Anal.Chem．(王盈予，夏曦，李曉薇，丁雙陽，沈建忠.分析化學)，2014，42(3)：409-414.

[6] Wu L Q，Fang B H，Xiao T A，Deng G D.Chin.J.Veter.Drug(吳荔琴，方炳虎，肖田安，鄧國東.中國獸藥雜志)，2010，44(7)：19-22.

[7] GB/T 22983-2008.Determination of Six Polyether Antibiotics Residues in Milk and Milk Powder-LC-MS/MS Method.National Standard of the People’s Republic of China(液相色譜-質譜法測定牛奶和奶粉中六種聚醚類抗生素.中華人民共和國國家標準).

[8] Galarini R，Fioroni L，Moretti S，Pettinacci L，Dusi G.Anal.Chim.Acta，2011，700(1/2)：167-176.

[10] Rogeberg M，Malerod H，Roberg-Larsen H，Aass C，Wilson S R.J.Pharm.Biomed.Anal.，2014，87：120-129.

[11] Helfer A G，Meyer M R，Michely J A，Maurer H H.J.Chromatogr.A，2014，1325：92-98.

[12] Gorga M，Insa S，Petrovic M，Barcelò D.J.Chromatogr.A，2014，1352：29-37.

[13] Ai L F，Ma Y S，Chen R C，Guo C H，Kang Z S.Chin.J.Anal.Chem.(艾連峰，馬育松，陳瑞春，郭春海，康占省.分析化學)，2013，41(8)：1194-1198.

[14] Huang X F，Liu Z J，Chen J，Dai Z Y，Xu Q，Zhuang G S.J.Instrum.Anal.(黃雄風，劉召金，陳靜，戴振宇，許群，莊國順.分析測試學報)，2014，33(1)：39-44.

[15] Zhang H C，Ai L F，Guo C H，Zhang J W，Ge S H，Dou C Y，Liu H L.J.Instrum.Anal.(張海超，艾連峰，郭春海，張婧雯，葛世輝，竇彩云，劉慧玲.分析測試學報)，2014，33(3)：295-300.

[16] Mi C L，Li S J，Wang F，Dong X C，Xu H，Ge B K，Chen Q Y.J.Instrum.Anal.(宓捷波，李淑靜，王飛，董襄朝，許泓，葛寶坤，陳其勇.分析測試學報)，2014，33(12)：1356-1361.

Rapid Determination of Polyether Antibiotics Residues in Animal-originated Foodstuffs Using TurboFlow On-line Clean-up Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CAO Ya-qing1， SONG Ge2， WANG Man-man1， WANG Xue-sheng1*， AI Lian-feng2*

(1.School of Public Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China；2. Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantion Bureau，Shijiazhuang 050000，China )

A new method using TurboFlow online cleanup combined with tandem mass spectrometry was developed for the rapid and simultaneous determination of six polyether antibiotics residues,e.g.lasalocid,salinomicin,monensin,narasin,maduramycin and nigericin in animal-originated foods of animal origin.The milk，chicken and egg samples were extracted with acetonitrile，and the extracts were purified on a Cyclone-p column.After being eluted from the clean-up column，the analytes were separated on a Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm×2.1 mm，5 μm) column and detected by electrospray mass spectrometry in positive ionization mode with multiple reaction monitoring.Under the optimized conditions，the linear ranges of six polyether antibiotics were in the range of 1-100 μg/L with correlation coefficients higher than 0.999.The limits of quantitation(LOQ) for all samples were 1 μg/kg.The recoveries from milk，chicken and egg samples were in the range of 71.9%-109.0% with relative standard deviations of 1.5%-14.9%.Key words：TurboFlow on-line cleanup；liquid chromatography-tandem mass spectrometry；polyether antibiotics；animal-originated foodstuffs

2016-03-17；

2016-04-07

國家自然科學基金項目(21305028)；河北省自然科學基金項目(B2013209238，H2016209018)；河北省教育廳自然科學項目(Q2012155)；國家質檢總局項目(2013IK154，2014IK092)

研究簡報

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.009

O657.63;O616.73

A

1004-4957(2016)10-1273-05

*通訊作者：王學生，碩士，教授，研究方向：衛生化學，Tel：0315-2592086，E-mail：xswang64@163.com

艾連峰，博士，研究方向：食品安全，Tel：0311-85980745，E-mail：ai_lianfeng@126.com